Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 30 )

Большой объем эякулята хряка осложняет технологию криоконсервации спермы и снижает экономическую эффективность метода, так как тебуются большие зартаты труда, много хладоагента, помещении для хранения криоконсервированных сперматозоидов и т. д.

На конечный результат криоконсервации существенно влияет скорость падения температуры на этапе глубокого замо­раживания спермы, что зависит от многих факторов и в первую очередь от состава разбавителей, свойств и концентрации криопротектора, концентрации клеточной суспензии, объема замо­раживаемой массы и т. д.

Преимущество быстрого режима замораживания подтверждено в опытах В. Милованова и др. [44] с использованием автоматической морозильной установки с программным управлением. В зависи­мости от скорости продолжительность охлаждения от 0 до -180 °С при использовании полиэтиленовых пакетов вмести­мостью 50 мл варьировала от 45 до 1,5 мин. Оттаивали сперму в водяной бане при температуре 38 ... 40 °С. Контроль - гра­нулирование на сухом льду. С ускорением режима замораживания подвижность спермиев повышалась и была наилучшей при максимально быстром падении температуры для данной установки (от 0 до -180 °С в течение 3 мин, 60 °С/мин).

На выживаемость спермиев при быстром замораживании существенно влияет переохлаждение, т. е. снижение темпера­туры ниже точки фазового перехода без затвердевания. Оказа­лось, что чем ниже температура, до которой произошло пере­охлаждение спермы, тем хуже выживаемость спермиев. Наи­лучшая выживаемость достигается в том случае, когда удается избежать переохлаждения. Этого можно добиться, если сокра­тить весь период охлаждения до 2-3 мин.

Большинством методов криоконсервации спермы хряков в гранулах предусматривается использование в качестве хладоагента твердой углекислоты с последующим хранением их в жидком азоте. В производственных же условиях более эконо­мически выгодно замораживание в парах жидкого азота, так как при этом не нужно доставлять и хранить дополнительный хладоагент - сухой лед. Кроме того, азот менее токсичен, чем углекислота, при его использовании можно создать более сте­рильные условия, автоматизировать процесс гранулирования и расширить диапазон температуры замораживания.

Результаты сравнительных испытаний по комплексу физио­логических и биохимических показателей спермы, заморожен­ной на твердой углекислоте и в парах жидкого азота в различ­ных средах, свидетельстуют о необходимости в каждом конкрет­ном случае дифференцированно подходить к выбору режима замораживания и хладоагента.

Наименьшее снижение ско­рости наблюдается в зоне перед началом кристаллизации (от 0 до 1 °С) и составляет всего 1,0... 1,5 °С/мин, тогда как в кри­тической зоне температур (от -20 до -60 °С) эта скорость достаточно высока (20 °С/мин), что позволяет быстро пройти опасную для клеток кристаллизационную зону замерзания. Существенно влияет на жизнеспособность спермы, замороженной в гранулах разного объема, способ оттаивания.

Проведенные экспериментальные работы позволили нам составит рекомендацию по получению (рис.14) и использованию нового разбавителя спермы хряков – ГЦДУМЖ, которая состоит из следующих основных биотехнологических этапов (рис. 15):

Рисунок 14 - Рекомендуемая технология получение и хранение спермы с новыми разбавителями.

Рисунок 15 - Рекомендуемая биотехнологическая последовательность криоконсервации спермы хряков с использованием нового разбавителя (ГЦДУМЖ)

Экономическая эффективность исследований

Основой эффективного ведения свиноводства является целенаправленная работа по повышению воспроизводительных качеств животных, направленная на повышение производства продукции при минимальных затратах. Экономический эффект, полученный в новых разработок, определяли путем сопоставления производственных затрат, связанных с проведением исследо-ваний при его сравнении с базовым.

Результаты экономической эффективности от внедрение новой среды для криоконсервации и оттаивания приведены в таблице 64.

Таблица 64 – Экономическая эффективность разработанной среды для cпермы хряков

Разработки и экономические показатели	Ед. изм.	Эффективность способов
базовый	новый
Усовершенствованная среда для криоконсервации спермы
Себестоимость одной заготовленной криоконсервированной спермодозы	тенге	193	164
Реализационная цена	тенге	275	275
Прибыль	тенге	82	111
Рентабельность		42,4	67,6

Экономический эффект от внедрения новой среды для криоконсервации спермы позволяет снизить себестоимость заготовленной спермодозы на 21 тенге (164 тенге) и довести рентабельность до 67,6%, или на 25,2% больше, чем при традиционном.

Таким образом, экономический анализ убедительно доказывает достаточно высокую эффективность новых научных разработок и необходимость внедре-ния их в технологию искусственного осеменения в свиноводстве.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Полученные нами данные экспериментальных исследований позволили: развить имеющиеся знания по криобиотехнологии сперматозоидов, показать взаимосвязи между содержанием сульфгидрильных групп и качеством эякулята, степень важности тиоловых соединений в механизмах ферментативного регулирования энергетического обмена и криоустойчивости сперматозоидов и сделать следующие основные выводы:

- определены параметры взаимосвязи между содержанием сульфгидрильных групп (SН-) спермы хряков и ее качественными показателями.

- теоретически обоснованы и практитчески решены способы защиты сульфгидрильных групп спермы хряков с помощью тиоловых соединений и серосодержащих реагентов, вскрыты механизмы защиты спермы при их кратковременном хранении, криоконсервации и оттаивании.

- из тиоловых соединении наиболее благоприятное влияние на сохранности функциональной полноценности половых гамет получены от унитиола и дитиотреитола.

- для кратковременного хранения спермы хряков на основе унитиола и дитиотреитола разработана новая среда глюкозо-цитратно-дитиотретиоло-унитиоловая (ГЦДУ). Новый разбавитель ГЦДУ по сравнению с существующими аналогами имеет следующие преимущество: предотвращает от окисления структурных сульфгидрильных групп сперматозоидов и тиоловых ферментов плазмы, что в свою очередь способствуют увеличение жизнеспособности спермиев, стабилизирует процессы окислительного фосфорилирования, сохраняет целостности акросом гамет и увеличивает сроки пригодности гамет к оплодотворению. Удлинение срока сохранности оплодотворяющей способности сперматозоидов (до 5 суток) позволит сократить поголовья хряков-производителей, сэкономить корма на 30-33% и использовать освободившие помещения для содержания свиноматок, получать от них дополнительную продукцию, использовать только высокоценных, проверенных по качеству потомства производителей.

- потеря оплодотворяющей способности сперматозоидов хряка после замораживания-оттаивания связана с рядом структурных, биохимических изменений сперматозоидов: нарушением упорядоченности и целостности мембран плазматической и акросомальной оболочек, а также митохондрий, выходом ферментов, в том числе и ЛДГ из клеток и частичной ее инактивацией, разобщением дыхания и фосфорилирования,

- разработана новая среда для криоконсервации эякулятов хряков: глюкозо-хелато-цитратно-глицерино-дитиотреитоло-унитиоло-мочевино-желточная (ГЦДУМЖ). Новый разбавитель ГЦДУМЖ по сравнению с существующими аналогами имеет следующие преимущество: при криоконсервации (-1960С) и оттаивании (+370С) спермы хряков меньше разрущаются структурные белки и ферменты гамет, вследствие чего лучше сохраняются оплодотворяющей способности заморожено-оттаянных сперматозоидов.

Применение ГЦДУМЖ позволить повысить эффективность использования генефонда высокоценных хряков-производителей.

- определены что в процессе замораживания-оттаивания в сперматозоидах происходят значительные деструктивные изменения мембранных структур, в результате чего происходит быстрый гидролиз АТФ под действием содержащихся в клетках и семенной плазме ферментов. Эти изменения можно в определенной степени снизить применяя диализный метод разбавления спермы перед замораживанием.

- криозащитное действие тиоловых соединений связано с их антиокислительным действием, предотвращающим окисление SH-групп белковых молекул, что приводит к специфическому повышению устойчивости мембранных структур и функционирования дыхательной цепи митохондрий сперматозоидов.

2. Поставленные для решения задачи полностью выполнены. Разработаны разбавитель для криоконсервации спермы хряков превосходящих отечественных и зарубежных аналогов. При замораживании-оттаивании эякулятов хряков в новом разбавителе ГЦДУМЖ по сравнению с другими аналогами получены следующие результаты: активность сперматозоидов выше на -25,1%, сохранность акросом на – 30,2%, сохранность сульфгидрильных групп на – 28,9%, оплодотворяющая способность гамет на 9,8%.

3. Разработаны рекомендации по конкреному использованию резульататов.

Для увеличения степени использования высокоценных племенных, проверенных по качеству потомства хряков производителей рекомендуем:

а) для кратковременного хранения спермы использовать

глюкозо-цитрато-дитиотреитоло-унитиоловая (ГЦДУ) среду имеющую следующий состав (на 1000 мл воды) г: глюкоза - 45,0 г, цитрат натрия - 4,15 г, натрий двууглекислый - 0,75 г, цитрат натрия – 2,5 г, дитиотреитол – 0,15 г, унитиол – 0,27 г, спермосан-3 – 6,0 г

б) для криоконсервации эякулятов хряков и повышение криоустойчивости гамет при биотехнологических работах применять среду (ГЦДУМЖ), имеющую следующий состав (на 1000 мл воды): глюкоза – 50,0 г, цитрат натрия – 2,8 г, цитрат калия – 0,6 г, хелатон – 1,2 г, унитиол – 0,18 г, дитиотреитол – 0,7 г, желток – 80 мл, глицерин – 45 мл, мочевина – 3,0 г.