Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 5 )

По данным [68] введение в состав среды ионов калия (К+) препятствует диффузионному выходу ионов калия из клеток при субнулевых температурах и повышает переживаемость сперматозоидов хряка после замораживания-оттаивания. [45] отмечает положительное влияние на устойчивость связей белково-липидных комплексов оказывает при охлаждении и замораживании спермы оказывает и введение ионов Mg2+ и Сa2+ или использование в составе среды хелатных комплексонатов Са2+ и Mg2+ ([69]; [13]), которые способствуют регуляции содержания двухвалентных катионов в системе клетка-среда для хранения.

Важное значение при охлаждении и хранении спермы, при субнулевых температурах имеет наличие в составе среды компонентов, обеспечивающих защиту сперматозоидов от температурного шока. H. A.Lardy и P. H.Phillips [70] обнаружили, что чувствительность сперматозоидов к температурному шоку, значительно снижается, при добавлении в среду яичного желтка. С этих пор желток куриного яйца стал обязательным компонентом в составе сред для криоконсервации спермы млекопитающих. Механизм защитного действия желтка окончательно не выявлен. Наиболее распространенной версией защитного действия считается встраивание ненасыщенных липидных фракций желтка в мембранные структуры сперматозоидов. В результате чего точка затвердевания (фазового перехода) мембран сдвигается в зону более отрицательных температур.

По данным [13] устойчивость мембран к повреждающему действию низких температур зависит от надмолекулярной структуры мембранных липидов: она повышается со снижением параметра упорядоченности липидов. Защитное действие желтка объясняется тем, что его компоненты, при обработке сперматозоидов, параллельно снижению температуры фазового перехода снижают параметр упорядоченности липидов.

Видовые различия сперматозоидов хряков и быков в устойчивости при замораживании, по представлению автора, связаны с тем, что степень разупорядочивания липидов мембран сперматозоидов быка выше, чем у сперматозоидов хряка. Косвенным подтверждением данной концепции является повышение криоустойчивости сперматозоидов при введении в среду холестерина [43]. [71] установил, что холестерин оказывает уплотняющее действие на бислойную мембрану, если она находится в жидком состоянии, т. е. углеводородные цепи в ней малоупорядочены. Если же состояние цепей гелеобразное, эффект холестерина противоположен: он снижает температуру фазового перехода бислоя. Предполагают, что благодаря такому двоякому эффекту холестерин может выполнять функцию биологического регулятора, обеспечивающего надлежащее состояние липидной части мембраны, необходимое для ее нормального функционирования клетки.

1.1.5 Теоретические основы механизма защиты сперматозоидов куриного желтка

Защитные свойства желтка первоначально приписывались содержащемуся в нем фосфатидилхолину (лецитину) [72]. Так, при введении в среду фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола, наибольший защитный эффект оказывал фосфатидилхолин. На устойчивость плазматических мембран при действии низких температур влияет устойчивость липидных фаз фосфатидилхолина - охлаждение фосфатидилхолина ниже температуры фазового перехода приводит к образованию стабильного геля, в то время как фосфатидилэтаноламин превращается в кристаллический коагель. Еще более выраженные защитные свойства от холодового воздействия, чем у фосфатидилхолина, оказались у другого фосфолипида - фосфотадилсерина, особенно в сочетании с холестерином [73].

Последующие исследования показали, что защитные свойства желтка, при температурном шоке, обусловлены не столько фосфолипидной, сколько липопротеидной фракцией желтка. Причем наиболее эффективными криозащитными свойствами обладают липопротеиды высокой плотности a-липопротеиды, отличающиеся высоким содержанием белка и низким - холестерина [73]. Эти данные согласовываются с результатами исследований Н. Masuda, J. Nishikawa [74] и J. A. Foulkes [75]). При этом на семени козлов более эффективными оказались не a - липопротеиды, а b - липопротеиды.

Иммунохимическое исследование взаимодействия липопротеинов яичного желтка со сперматозоидами быка показало, что липопротеиды III-фракции прочно прикрепляются к сперматозоидам, образуя необратимое соединение с оболочкой сперматозоидов, которое не нарушается механическим путем или длительным промыванием спермиев.

[36] и Г. Kichev [76] защитные свойства желтка объясняют тем, что содержащиеся в желтке фосфолипиды и липопротеины имеют химическое сродство с липопротеидными мембранами, благодаря чему они наслаиваются на их поверхности и образуют гидрофобную фазу, в которой не растворяются осмотические активные вещества. И поэтому осмотический и диффузионный обмен между клеткой и окружающей средой сильно замедляются. Кроме того, при наслоении фосфолипидов значительно увеличивается толщина наружной оболочки, что увеличивает время проникновения осмотических активных веществ через оболочку сперматозоидов.

В подтверждение своей гипотезы авторы ссылаются на результаты опытов, где показано, что после контакта с компонентами желтка сперматозоиды и эритроциты теряли способность вступать в реакции связывания с комплементами. В качестве аргумента в пользу данной гипотезы защитного действия желтка свидетельствуют и результаты опытов L. Robertson и P. F. Watson [77]. При медленном охлаждении спермы баранов (0,25 град/мин) до +5° С в среде с экзогенным Са2+, наблюдалось шестикратное увеличение ионов Са2+ к концу периода охлаждения. В результате чего резко снижалось число подвижных сперматозоидов с 84,2% до 3,3%. При добавлении в среду желтка накопление Са2+ внутри сперматозоидов уменьшалось пропорционально уровню добавки куриного желтка.

В пользу предположения [36] о механизме защитного действия желтка говорят также данные об использовании в составе сред для замораживания спермы хряков детергента S-амино-Na-лаурилсульфата (ОЕР). Использование ОЕР в сочетании с желтком в среде для замораживания спермы хряков значительно повышало эффективность криозащитных свойств желтка, в то время как применение одного ОЕР, наоборот, приводило к снижению выживаемости сперматозоидов. По-видимому, ОЕР при отсутствии желтка приводит к образованию дефектов во внешней мембране сперматозоидов хряка, которые при охлаждении и замораживании-оттаивании спермы усиливаются и разрастаются. В то время как ОЕР в сочетании с желтком образует на поверхности оболочки сперматозоидов тонкую пленку, которая прочно связывается со сперматозоидами образуя как бы дополнительную “реконструированную мембрану" гамет.

Аналитического взгляда в трактовке защитного действия сочетания желтка с ОЕР придерживается и [13] с сотрудниками.

Установлены, что кроме фракций фосфолипидов и липопротеидов в желтке куриных яиц содержатся также нейтральные жиры. При исследовании влияния нейтральных жиров на выживаемость сперматозоидов козла после температурного шока по сравнению с очищенным фосфатидилхолином (летицином) желтка и липопротеидами коэффициент криозащиты составил: 83,3% - для нейтральных жиров, 38,4% - для фосфатидилхолина и 62,5% - для a - и 78,1 для b - липидов. Коэффициент защиты нейтральными жирами для сперматозоидов быка составил - 90,7%. Подтверждением эффективности действия нейтральных жиров при защите сперматозоидов хряка от повреждающего действия холода служат исследования [67], в которых показано, что водная эмульсия подсолнечного масла в соотношении 1:1 не уступает по криозащитным свойствам желтку и липидам желтка.

Наиболее эффективно защитные свойства желтка проявляются при температурах до начала кристаллизации. При замораживании защитные свойства не проявляются или проявляются очень слабо.

1.1.6 Теоретические основы механизма защиты сперматозоидов различных видов сахара и глицерина

В настоящее время известно, что способностью защищать клетки при замораживании обладают растворы сахаров. B. J. Luyet и E. L. Hodapp [3] показали, что применение 40-50%-ного раствора сахарозы обеспечивает сохранению около 20% сперматозоидов лягушки после замораживания при температуре жидкого воздуха, а при добавлении фруктозы выживало до 30% сперматозоидов петуха, подвергшихся замораживанию при температуре -79° С.

Сравнительное исследование [78], Н. Nagase и Т. Niwa [79] криозащитных свойств различных сахаров выявило, что дисахара - сахароза и лактоза обладают большими криозащитными свойствами, чем моносахариды. В исследованиях S. Salamon et al. [80] не было выявлено преимущества сахарозы, арабинозы, ксилозы, маннозы и раффинозы перед глюкозой и было обнаружено явное преимущество фруктозы по сравнению с глюкозой и лактозой. Но однозначно, что более эффективно криозащитные свойства сахаров по и др. [81] проявляются при использовании их в сочетании. По мнению [7] защитное действие сахаров связано с их способностью структурировать молекулы внутри и внеклеточной воды, а также изменять температуру кристаллизации.

Крупным поворотом в развитии криобиологии явилось “вторичное открытие” английскими ученым C. К. Polge [82] защитного действия глицерина при замораживании биологических объектов.

Хотя защитное действие глицерина было открыто сравнительно давно русскими учеными Ю. Максимовым [83] и и др. [84], заслуга английских ученых, которым часто приписывается приоритет данного открытия, заключается в том, что оно было изучено на многих тканях и органах млекопитающих при самых разнообразных температурах. Эти работы положили начало широкому использованию глицерина в качестве защитного вещества при криоконсервации клеток..

После первых удачных результатов полученных при криоконсервации спермы петухов под руководством [85] в среде содержащей глицерин были заморожены и сперматозоиды млекопитающих, в том числе и сельскохозяйственных животных: быков, баранов, хряков, жеребцов и др. К настоящему времени уже известно более 100 химических соединений обладающих криопротекторными свойствами, но при замораживании спермы сельскохозяйственных животных, ни одно из проверенных веществ не оказалось лучше глицерина. В частности были испытаны: полиэтиленоксиды с различной молекулярной массой, диметилсульфоксид (ДМСО), NN-диметилацетамид (ДМА), этиленгликоль, эритротол, поливинилпирролидон, диметилформамид и ряд других веществ.