Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 26 )

Показатели	Варианты опыта
ГХЦЖК (контроль)	ГХЦЖК + унитиол+мочевины (опыт)	Разница ±	в %
Подвижность, баллов	3,0±0,02	3,1±0,01	+ 0,1	3,3
Скорость движения, мкМ/с	95,8±8,05	96,2±7,64	+ 0,4	0,4
Абсолютный показатель живучести, ч	2,5±0,01	3,4±0,02	+ 0,9	36,0
Время редукции метиленовой сини, мин	16,7±0,45	14,5±2,03	- 2,2	-15,2
Сохранность SН-групп, %	62,2±5,13	70,4±6,52	+ 8,2	13,2
Число поврежденных акросом, %	31,8±3,04	23,7±1,86	- 8,1	-34,2
Активность общих дегидролгеназ, мин	54,4±6,06	48,7±4,63	- 5,7	-11,2
Активность цитохромоксидазы, мин	6,8±0,16	14,4±0,09	+ 7,6	211,7

Таким образом изменение состава среды введением унитиола в концентрации 0,028% и мочевины 0,30% позволяет повысить процент подвижных клеток и абсолютный показатель живучести после замораживания-оттаивания. Улучшение функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков дали нам основание включить этих веществ, в состав разрабатываемой новой среды для криокнсервации спермы хряков.

3.3.5 Исследование влияния тиоловых соедиенеий на некоторые структурно-метаболические показатели заморожено-оттаянной сперматозоидов

Для выяснения механизма действия тиоловых соединений на криоустойчивость сперматозоидов и определения направления для дальнейшего совершенствования технологии замораживания было исследовано влияние тиоловых соедиенеий на структурно-метаболические показатели гамет хряков. После замораживания-оттаивания у сперматозоидов оценивали сохранность акросом, ферментов лактатдегидрогеназы и цитохромоксидазы.

Наряду с этим также определяли интенсивность дыхания и состояние дыхательной цепи. Как видно из таблицы 55 унитиол, дитиотреитол и меркаптоэтанол достоверно снижает долю сперматозоидов с поврежденной акросомой.

Таблица 55- Влияние тиоловых соедиений на сохранность акросом после замораживания и оттаивания спермы

Вариант опыта	Число сперматозоидов с поврежденными акросомами, %
M+m	lim	Р
ГХЦЖКМ - контроль	28,42±3,12	10,7 - 35,6	-
ГХЦЖКМ - унитиол	20,76±2,56	12,9 - 26,8	0,05
ГХЦЖКМ- меркаптоэтанол	18,12±3,23	5,8 – 25,6	0,01
ГХЦЖКМ-цистеин	30,48±4,02	13,6 – 40,3	0,02
ГХЦЖКМ-дитиотреитол	20,78±3,56	11,9 – 26,6	0,01

При добавлении в среду дитиотреитола и унитиола сохранность акросом сперматозоидов находится на уровне 79,12-79,14%, что выше чес в контроле на 7,8-8,0% (табл. 55).

Анализ полученных результатов (рис. 10) показал, что цистеин не защищает акросому сперматозоидов хряка от повреждающего действия замораживания-оттаивания. Кроме того цистеина не оказывает защитного влияния и на сохранность в сперматозоидах фермента лактатдегидрогеназы (табл. 56). Не отличалась активность лактатдегидрогеназы от контроля и в пробах замороженных с меркантоэтанолом.

Обнаружено также, что по сравнению с контролем унитиол и дитиотреитол достоверно увеличивает сохранность фермента сперматозоидов. Исследование активности цитохромоксидазы измеряемой по времени развития окраски показало, что все тиоловые препараты уменьшают активность данного фермента, участвующего в терминальном участке дыхательной цепи. Наибольшее снижение активности, более 10 раз, наблюдалось в пробах замороженных с меркаптоэтанолом (табл. 56).

Повидимому такое снижение активности (ингибирования) цитохромоксидазы связано с переключением дыхания преимущественно на аэробный гликолиз.

В контрольном опыте было установлено, что используемые в опытах тиоловые соединения обладают гипоксическим действием. Скорость поглощения кислорода из среды унитиолом, дитиотреитолом и меркаптоэтанолом составляет 2...4 натомов О2 в мин.

Рисунок 10- Влияние тиоловых соедиений на сохранность акросом

Таблица 56- Активность лактатдегидрогеназы и цитохромоксидазы в замороженно-оттаянной сперме хряков

с тиоловыми соединениями

Вариант опыта	Актиность ЛДГ в мкМ пирувата на 109 сперматозоидов	Активность цитохромоксидазы, мин
М	D±md	Р	М	D±md	Р
ГХЦЖКМ - контроль	6,9	-	-	5,1	-	-
ГХЦЖКМ - унитиол	7,7	0,32±0,1	0,02	15,9	10,3±0,9	0,05
ГХЦЖКМ - меркаптоэтанол	6,8	0,48±0,1	0,01	54,6	48,3±4,1	0,01
ГХЦЖКМ-цистеин	7,5	0,19±0,1	0,02	10,9	5,8±0,7	0,05
ГХЦЖКМ-дитиотреитол	7,6	0,31±0,1	0,02	15,2	9,8±0,8	0,01

3.3.6 Влияние тиоловых соединений на показатель энергетического обмена в сперме хряков на разных этапах замораживания

Энергетические основы подвижности сперматозоидов были раз­работаны советскими и иностранными учеными (Маnn Т.[34], [167]). Исследователи показали, что цен­тральная роль в энергетике принадлежит аденозинтрифосфату.

Содержание АТФ является важным фактором в регуляции дви­жения сперматозоидов. По данным и др. [90], содержание АТФ в сперме быка и барана 8,7 и 8,6 мг в 100мл, а в сперме хряка - 3,3 мг. Показан параллелизм между содер­жанием АТФ и подвижностью спермиев. Количество АТФ, бы­стро расходуемого в процессе движения сперматозоидов, поддер­живается на постоянном уровне с помощью двух взаимосвязан­ных процессов - гликолиза и дыхания. Следует напомнить, что гликолитический процесс слагается из ряда последовательных ферментативных реакций, в результате которых глюкоза ока­зывается расщепленной на две молекулы молочной кислоты.

Определение АТФ в образцах сперматозоидов. Эксперименты проведены на сперме хряков крупной белой породы. В связи с отсутствием АТФ в семенной плазме, предварительное отделение сперматозоидов от плазмы не проводилось.

Экстрагирование АТФ из сперматозоидов проводилось по методу с соавторами [233]. Для этого из каждого образца спермы отбирали пробу объёмом 0,05 мл и добавляли в неё 0,45 мл диметилсульфоксида. После 20 минутной экстракции при комнатной температуре определяли содержание АТФ биолюминисцентным методом с помощью портативной люминометра ЕМILIТЕ-1003А. Для проведения анализа в кювету люминометра помещали 0,5 мл АТФ реагента, содержащей иммобилизированную люциферазу светляков, люцеферин, соль магния, компоненты буферной смеси и стабилизаторы, и регистрировали фоновое свечение. Затем в кювету вводили экстрагированный образец спермы в объеме 0,1 мл и регистрировали приращение интенсивности свечения (I обр.). Для проведения внутренней калибровки, в ту же кювету вводили 0,1-0,2 мл стандартного раствора АТФ и регистрировали приращение сигнала.

Расчет концентрации АТФ в образце проводили по формуле:

АТФ обр. = Vcт • Jст / Jст • АТФ ст

где: Vст. и Vобр.- объём соответственно стандарта АТФ и образца, АТФ ст.- концентрация АТФ в стандарте.

Содержание АТФ в сперматозоидах животных напрямую коррелирует с их подвижностью и оплодотворяющей способностью ( и др [55], Foulkes J. А. [75], Кichev G. [76], Wilmut I. е. а. [86]).

В связи с совершенствованием методов криоконсервации спермы хряков представляет несомненный практический интерес изучение динамики содержания АТФ в сперматозоидах под влиянием глубокого замораживания в зависимости от методов криоконсервации.

Результаты эксперимента по изучению содержания АТФ в сперматозоидах хряков представлены в табл. 57. Из этой таблицы видно, что в процессе замораживания-оттаивания происходит резкое снижение уровня АТФ в сперматозоидах хряков. Через 5 минут после оттаивания уровень АТФ снизился на 37,7% по сравнению с нативными образцами.

Таблица 57- Влияние глубокого замораживания на содержание АТФ в сперматозоидах хряка

Время исследования	Подвижность сперматозои­дов, %	Число сперматозоидов с неповрежденной акросомой, %	Содержание АТФ в сперматозоидах, нмоль/108кл
До замораживания	81±5,3	93±4,2	26,8±0,6
Через 5 мин. после оттаивания	37±1,9Х	56±2,8ХХ	16,7±1,3
Через 60 мин. после оттаивания	21±1,3Х	43+2,9 хх	7,1±0,3ХХ
Через 120 мин. после оттаивания	18±0,4ХХ	37±1,9ХХ	5,2±0,2ХХ
х-Р<0,05; ХХ-Р<0,01

Наряду с этим также уменьшилось на 54,4% подвижность сперматозоидов и 39,8% число сперматозоидов с поврежденной акросомой. Дальнейшая инкубация оттаянных образцов при 37°С способствовала значительному снижению подвижности и содержания АТФ в сперматозоидах. Через 2 часа после оттаивания содержание АТФ в сперматозоидах снизилось в 5,15 раза по сравнению с начальным уровнем (Р<0,01). Следовательно, в процессе замораживания-оттаивания в сперматозоидах хряков происходят значительные деструктивные изменения мембранных структур, в результате чего происходит быстрый гидролиз АТФ под действием ферментов, которые содержатся в клетках и семенной плазме.