Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 12 )

3.1.2 Влияние низкомолекулярных тиоловых соединений на дегидрогеназную активность и абсолютный показатель живучести сперматозоидов

В настоящее время в сперматозоидах выявлены различные дегидрогеназы, участвующие в окисление субстратов цикла Кребса: сукцинатдегидрогеназа, пируватдегидрогеназа, дегидрогеназа яблочной и α-кетоглютаровой кислот. Кроме того, установлена активность α-глицерофосфатдегидрогеназы и полиалкоголь - дегидрогеназы, что свидетельствует об утилизации в спермиях глицерина и многоатомных спиртов – сорбитола и ионизитола. Учитывая, что в метаболизме гамет самцов активно принимают участие тиоловый фермент – дегидрогеназа, проведено изучение влияния низкомолекулярных тиоловых соединений на изменение ферментативную активность спермы хряков-производителей.

Восстановленный глутатион (Г - SН) является коферментом ряда ферментных систем организма. Кроме того восстановленный глутатион выполняет защитные функции, предохраняя белковые SН-группы от окисления и блокирования различными ядами клеток организма.

Таблица 3- Влияние восстановленного глутатиона на абсолютный показатель живучести (АПЖ) и дегидрогеназную активность сперматозоидов хряков ( при +20С)

Концентрация Г – SН, ( М)	Срок хранения сперматозоидов (час)	АПЖ
0	3	6	9	12	24
Активность дегидрогеназ (мин)	ед.	%
Контроль (без реагента)	49	59	50	60	63	48	9,71	100,0
Продолжение таблицы 3.
6,5· 10-4	45	51	47	54	71	65	9,47	97,4
1,6· 10-4	38	44	40	49	47	50	9,56	108,2
3,3· 10-3	30	29	34	44	48	55	8,51	87,3
1,6· 10-2	30	29	35	44	48	56	7,16	72,1
2,6· 10-2	28	32	30	31	32	40	0,77	8,4
3,3· 10-2	53	86	99	110	110	101	0,02	0,3

Восстановленный глутатион использовали в концентра­циях от 6,5 · 10-4 до 3,3 · 10-2 М. Г - SН в концентраци­ях 6,5 · 10-4 - 1,6 · 10-3 М почти не влияет на подвиж­ность и переживаемость гамет самцов. По мере увеличения концентрации Г - SН переживаемость сперматозоидов за­метно снижается и при концентрациях, равных 2,6 · 10-2 - 3,3 · 10-2 М, движение сперматозоидов быстро прекраща­ется и они погибают.

Активность дегидрогеназ (табл.4) повышается при использова­нии реагента в концентрациях 6,5· 10-4 - 2,6 · 10-2 М. При концентрации 1,6 · 10-2 М активность дегидрогеназ увеличивается более чем в два раза по сравнению с конт­ролем. Повышение концентрации Г - SН до 3,3 · 10-2 М приводит к снижению дегидрогеназной активности почти в 2 раза по сравнению с исходным уровнем.

Для выяснения вопроса о возможности проникновения восстановленного глутатиона через мембрану сперматозоидов, нами определены со­держание SН-групп в отмытых сперматозоидах до и после добавления реагента методом амперометрического тит­рования (табл. 4).

Таблица 4- Результаты титрования SН-групп в сперматозоидах до и после добавления восстановленного глутатиона

Время инкубации ( час)	Количество SН-групп в сперматозоидах (мкМ/108 клеток)
до добавления восстановленного глутатиона	после добавления восстановленного глутатиона
0	11,5	12,2
3	10,8	12,6
9	13,1	18,8
12	13,1	18,0
24	13,2	17,6

Из таблицы 4 видно, что добавление восстановленного глутатиона вызывает некоторое увеличение числа SН-групп в сперматозоидах, осо­бенно это заметно через 9 и 24 часа инкубации исследуемых образцов. Эти данные показывают, что восстановленный глютатион медленно проникает через мембрану сперматозоидов.

Цистеин является аминокислотой содержащий сульфгидрильные группы. Цистеин широко используется для снятия торможения, вызванного тиоловыми ингибиторами.

Действие цистеина на SН–групп спермы сходно с действием восстанавленного глутатиона. Цистеин широко используется для снятия торможения, вызванного различными тиоловыми ингибиторами.

Из таблицы 5 видно, что низкие концентрации (6,7·10-6-1,7·10-5 М) цистеина стаблизируют подвижность и увеличивают абсолютный показатель живучести половых клеток на 15-21 %, а высокие концентрации (6,7·10-3-1,7·10-2 М) снижают эти показатели параллельно с повышением концентрации реагента.

Низкие концентрации (6,7·10-6-6,7·10-5 М) цистеина в первые часы инкубации спермы, несколько повышает активность дегидрогеназ, а в дальнейшем значительно ингибируют ее (6 таблица).

Таблица 5- Влияние цистеина на подвижность и переживаемость сперматозоидов хряков

Концентрация цистеина (м)	Срок хранения спермы (час)	Абсолютный показатель живучести	Р
0	1	3	6	9	12	24
Активность сперматозоидов (баллы)	ед	%
Контроль 6,7∙10-6 6,7∙10-5 6,7∙10-4 6,7∙10-3 1,7∙10-2 3,3∙10-2 5∙10-2 8,3∙10-2 1,7∙10-1	0,79 0,80 0,80 0,75 0,70 0,80 0,71 0,70 0,52 0,25	0,76 0,75 0,79 0,70 0,44 0,35 0,20 0,05 0,04 0,01	0,67 0,70 0,65 0,62 0,23 0,15 0,04 - - -	0,52 0,60 0,57 0,500,13 - - - - -	0,42 0,53 0,50 0,42 0,04 - - - - -	0,35 0,45 0,37 0,35 0,01 - - - - -	0,06 0,15 0,17 0,10 - - - - - -	9,01 10,94 10,21 8,96 2,11 1,07 0,59 0,37 0,28 0,13	100 121 113,3 99,4 23,4 11,9 6,5 4,1 3,1 1,4	0,05 0,05 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001

Увеличение концентрации цистеина в сперме повышает активность дегидрогеназ на протяжени всего срока инкубации. Четыре наиболее высокие концентрации цистеина дают практически одинаковую активность дегидрогеназ спермы хряков. Это свидетельствует о том, что уже 3,3·10-2 М концентрация цистеина достаточно для максимальной активации дегидрогеназ спермы хряков.

Таблица 6- Влияние цистеина на дегидрогеназную активность спермы хряков

Концентрация цистеина (м)	Срок хранения спермы (час)
0	1	3	6	9	12	24
Активность дегидрогеназ (мин)
Продожение таблицы 6.
Контроль 6,7∙10-6 6,7∙10-5 6,7∙10-4 6,7∙10-3 6,7∙10-2 3,3∙10-2 5∙10-2 8,3∙10-2 1,7∙10-1	55 51 47 38 10 7 7 5 4 4	59 56 57 43 11 6 7 5 6 4	63 79 76 64 16 6 9 5 7 8	77 96 96 70 21 10 8 5 7 8	86 106 103 76 27 13 9 6 8 8	91 115 104 79 35 16 9 6 8 8	42 34 37 44 37 27 14 9 8 4

Опыты, проведенные на отмытых сперматозоидах (таблицы 7 и 8) показали, что 6,7·10-4 М концентрация цистеине, почти не влияющая на переживаемость сперматозоидов в цельной сперме, увеличивает пере-живаемость сперматозоидов, лишенных окружения плазмы на 8,1%; 6,7·10-3 М концентрация, снижающая переживаемость сперматозоидов в цельной сперме на 76,40 уменьшает переживаемость отмытых.

Высокие концентрации цистеина увеличивают активность дегидрогеназ цельной спермы примерно в 11 раз (таблица 6), а отмытых сперматозоидов только – в 5 раз (таблица 7).

Поскольку активность дегидрогеназ резко повышается при добавлении цистеина, мы изучили влияние цистеина на активность дегидрогеназ в плазме спермы. При этом было обнаружено, что после добавления к плазме спермы цистеина в высокой концентрации реакционная смесь окрашивается через 15,7 минут, хотя применяемый нами метод в обычных условиях вообще не выявляет дегидрогеназной активности плазмы спермы хряков

Высокие концентрации цистеина увеличивают активность дегидрогеназ цельной спермы примерно в 11 раз (таблица 6), а отмытых сперматозоидов только – в 5 раз (таблица 8).

Таблица 7- Влияние цистеина на подвижность и переживаемость отмытых сперматозоидов хряков

Концентрация цистеина (м)	Срок хранения спермы (час)	Абсолютный показатель живучести сперматозоидов	Р
0	1	3	6	9	12
Активность сперматозоидов (баллы)	ед	%
Контроль 6,7∙10-4 6,7∙10-3 3,3∙10-2 8,3∙10-2	0,58 0,58 0,52 0,25 0,06	0,560,56 0,44 0,10 0,01	0,38 0,42 0,26 0,02 -	0,14 0,18 0,06 - -	0,06 0,06 0,02 - -	0,02 0,02 - - -	2,71 2,93 1,78 0,27 0,03	100 108,1 65,7 10,0 1,1	0,05 0,01 0,001 0,001

Поскольку активность дегидрогеназ резко повышает при добавлении цистеина, мы изучили влияние цистеина на активность дегидрогеназ в плазме спермы. При этом было обнаружено, что после добавления к плазме спермы цистеина в высокой концентрации реакционная смесь окрашивается через 15,7 минут, хотя применяемый нами метод в обычных условиях вообще не выявляет дегидрогеназной активности плазмы.