Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 24 )

На основании вышеуказанных положительных влиянии реагента ан сперму хряков нами принято решение об изучении влияние унитиола на сохранность функциональной полноценности заморожено-оттаянной спермы хряков.

Влияние унитиола на активность и время переживания сперматозоидов при замораживании исследовались в концентрациях 0,014%; 0,021%; 0,028% и 0,035%. Полученные результаты по влиянию унитиола на активность и абсолютную показатель живучести криоконсервированных сперматозоидов приведены в таблице 47. Результаты исследования показывают как в таблице 47, что активность сперматозоидов замороженного в среде с унитиолом, после оттаивания значительно выше, чем в контроле.

Таблица 47- Влияние унитиола, добавленного в среду ГХЦЖК на активность и абсолютную показатель живучести (АПЖ) сперматозоидов после их замораживания-оттаивания

Концент-рация унитиолоа в % в среде	Активность сперматозоидов (А)	АПЖ (сохранение до 5% клеток)	АПЖ (потеря подвижности)
в баллах	А0 - Ак (D+md)	Р	в % к контрою	в часах	АПЖ0 - АПЖк (D+md)	Р	в % к контрою	В часах	АПЖ0 - АПЖк (D+md)	Р	в % к контрою
0 (контроль)	1,78	-	-	100,0	0,68	-	-	100,0	1,95	-	-	100,0
0,14	2,49	0,71±0,1	0,05	139,8	1,09	0,41±0,1	0,01	160,2	2,35	0,4±0,1	0,05	120,5
0,21	2,61	0,83±0,2	0,01	146,6	1,31	0,63±0,1	0,01	192,6	2,75	0,8±0,1	0,01	141,1
0,28	2,37	0,59±0,1	0,05	133,1	1,08	0,40±0,1	0,01	158,8	2,55	0,6±0,1	0,01	130,7
0,35	2,01	0,23±0,1	0,10	112,9	-	-	-	-	-	-	-	-

Достоверное увеличение активности сперматозоидов наблюдается под воздействием унитиола в концентрациях 0,014; 0,021; 0,028%. Наибольший процент подвижных сперматозоидов после замораживания-оттаивания спермы получено при использовании унитиола в концентрации - 0,021%.

Очень важным показателем жизнеспособности сперматозоидов является абсолютный показатель живучести, так как этот показатель высоко коррелирует с оплодотворяющей способностью половых клеток.

Абсолютный показатель живучести сперматозоидов, после замораживания-оттаивания в среде с унитиолом (при всех испытанных концентрациях), тоже выше времени переживания чем в контроле. Наибольшее увеличение абсолютного показателя живучести (138%) наблюдается при концентрации унитиола 0,021%. Еще большая разница между опытом и контролем обнаруживается при учете абсолютного показателя живучести сперматозоидов, до сохранения подвижности 5% половых клеток (табл. 48).

При концентрации унитиола 0,021% эта разница составляет 85,9%. Концентрация унитиола 0,014% хотя и увеличивает количество выживших после замораживания-оттаивания клеток, достоверного увеличения абсолютную показатель живучести гамет их (до потери подвижности) не вызывает. Действие же унитиола в концентрации 0,035% достоверно увеличивает только абсолютную показатель живучести гамет (рис. 8).

Таблица 48- Влияние унитиола, добавленного в среду ГХЦЖК на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков

Показатели	Варианты опыта
ГХЦЖК (контроль)	ГХЦЖК + унитиол (опыт)	Разница ±	в %
Подвижность, баллов	3,0±0,02	3,2±0,02	+ 0,2	6,7
Скорость движения, мкМ/с	96,4±7,21	96,8±6,87	+ 0,4	0.4
Абсолютный показатель живучести, ч	2,6±0,01	3,7±0,03	+ 1,1	42,3
Время редукции метиленовой сини, мин	17,9±0,92	14,9±0,08	- 3,0	-20,1
Сохранность SН-групп, %	61,9±5,13	72,6±6,52	+ 10,7	17,3
Число поврежденных акросом, %	32,5±2,89	21,9±1,23	- 10,7	-48,4
Активность общих дегидролгеназ, мин	53,2±4,11	45,8±3,35	- 7,4	-16,1
Активность цитохромоксидазы, мин	5,8±0,06	17,6±0,07	+ 11,8	303,4

Рисунок 8- влияние различных разбавителей на сперму хряков

Анализ таблицы 48 показывает, что после криоконсервации активность сперматозоидов с унитиолом выше на 0,2 балла или 6,6%, соответственно абсолютный показатель живучести на 1,1 часа или 42,3%; сохранность сульфгидрильных групп у сперматозоидов больше на 10,7 %; число поврежденных акросом ниже на 10,6%. В среде с унитиолом активность общих дегидролгеназ равна 45,8±3,35 мин, следовательно у гамет обменные процессы протекает более замедленном режиме.

Таким образом, полученные данные в ходе исследования показывают, что тиоловое соединение - унитиол способен сохранять целостность структурных элементов половых клеток, от воздействия сверхнизких температур и вполне может быть использован при разработке новой среды для криоконсервации половых клеток хряков-производителей,

3.3.3 Изучение влияние дитиотреитола на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков

Экспериментальные работы по исследованию влияния тиоловых соединений на устойчивость сперматозоидов при замораживании-оттаивании спермы хряков-производителей проведены в широком диапазоне концентраций реагентов. Так в частности - цистеамин 10-2 -10-6М, цистеин 10-2 ... 10-7М и меркаптоэтанол - 10-2 - 3·10-4 М. Опыты проводили на расщепленных эякулятах: эякулят делили на несколько частей и разбавляли средой ГХЦЖКМ с добавлением тиолового соединение, в испытываемых концентрациях. Контролем служила та же среда без тиоловых соединений.

Как видно из таблицы 49, антиоксидант дитиотреитол при хранении половых клеток 37°С оказывает определенное защитное влияние на замороженно-оттаянной сперматозоиды хряков. Наиболее положительное криозащитное действие получено при внесении дитиотреитола в концентрации 1·10-5 М. При указанном концентрации активность заморожено-оттаянных сперматозоидов находились на уровне 5,0-5,1 баллов, у 70-71% сперматозоидов акросомы были неповрежденными, а абсолютный показатель живучести сперматозо­идов (при 37°С) достигло 80,2-81,3 усл. ед.

Таблица 49- Влияние дитиотреитола на абсолютный показатель живучести и сохранности акросом оттаянных сперматозоидов

Концентрация дитиотреитола, в молях	Подвижность от­таянных сперма­тозоидов, %	Сперматозоиды с неповрежденной акросомой, %	Абсолютный показатель живучести сперматозо­идов при 37°С, усл. ед.
Контроль (без добавки)	36+0,6	51+3,2	64+2,6
1·10-2	39+1,9	59+3,6	74+3,7
1·10-3	45+2,1 *	66+3,7 *	74+3,4
1·10-4	47+3,3 *	70+4,3 *	78+4,8 *
1·10-5	51+1 ,2*	71+2,8 *	81+3,5 *
1·10-6	44+2,1	68+4,2 *	77+3,9 *
1·10-7	41+2,8	69+3,7 *	75+3,4 *
*= Р<0,05

Влияние дитиотреитола на активность и абсолюную показатель живучести (АПЖ) сперматозоидов после их замораживания-оттаивания при хранении в условиях +18°С представлены в таблице 50. Все иученные концентрации реагента (1·10-2 -1·10-7 М) оказали положительное влияние на криоконсервированной сперме хряков. Но особо криустойчивость половым клеткам оказали концентрация дитиотреитола 1·10-4 -1·10-5 М. При этих дозах реагента активность и абсолюную показатель живучести (АПЖ) сперматозоидов после их замораживания-оттаивания повышаются на 25,1 – 27,3%.

В следующей серии экспериментов, таблица 51, изучено совместимость дитиотреитола со средой ГХЦЖК. После добавления дитиотреитола (в концентрации 1·10-5 М) в среду ГХЦЖК скорость движения сперматозоидов составила в среднем 96,2 мкМ/с или примерно на уровне контрольной группой.

Дитиотреитол заметно улучшает абсолютный показатель живучести гамет. Так в частности в опытных образцах на в среднем составила 3,4 ч. или выше на 36.0%.

Таблица 50-. Влияние дитиотреитола на активность и абсолюную показатель живучести (АПЖ) сперматозоидов

после их замораживания-оттаивания

Концентрация дитиотреитола, М	Активность через	Абсолютный показатель живучести
0,5 часа	2 часа	в часах (М±m)	%	Р
М±m	Р	М±m	Р
ГХЦЖК –контроль	33,9±2,2	-	12,8±1,6	-	5,01±0,4	100,0	-
1·10-2	34,3±2,1	0,05	13,2±1,5	0,05	5,26±0,5	104,9	0,05
1·10-3	39,0±2,7	0,05	20,4±1,3	0,05	6,05±0,3	120,7	0,05
1·10-4	40,3±2,8	0,01	23,1±1,1	0,01	6,27±0,8	125,1	0,01
1·10-5	42,8±2,4	0,01	24,9±1,7	0,01	6,38±0,9	127.3	0,01
1·10-6	38,7±2,1	0,05	21,7±1,8	0,05	5,68±0,8	113,4	0,02
1·10-7	33,9±2,4	0,05	13,2±1,2	0,05	5,12±0,6	102,2	0,05

Таблица 51- Влияние дитиотреитола (1·10-5 М), добавленного в среду ГХЦЖК на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков