Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 4 )

1.1.2 Влияния низких температур на подвижность, оплодотворяющую способность и структуру сперматозоидов животных

Замораживание-оттаивание сперматозоидов быков и баранов ( [23]; [30]; [26]) вызывает некоторые нарушения в области шейки в виде просветления составных частей и набухания оболочки, а также разрывов оболочки и дезинтеграции структурных элементов. Все эти изменения выражены относительно меньше, чем изменения в области головки. При этом у сперматозоидов баранов, которые менее устойчивы к замораживанию-оттаиванию, эти нарушения встречаются чаще, чем у быков [23]. В результате замораживания-оттаивания наблюдается также отделение головок сперматозоида от шейки, разломы частей тела [30].

При замораживании-оттаивании спермы, а также холодовом шоке, хвостовая часть сперматозоида также претерпевает некоторые повреждения, хотя эти повреждения значительно меньше и реже выражены, чем нарушения в головке гамет ([31]; [23]; [26]).

[26] обнаружил, что при быстром охлаждении сперматозоидов быка наблюдается набухание и разрыв оболочки, целостности митохондрий и в некоторых случаях фибрилл. G. L. Rapatz и др. [32] наблюдали образование полостей в матриксе вокруг фибрилл и разрушение митохондриальной оболочки сперматозоидов.

P. J. Quinn и др, [33] отмечает просветление в матриксе митохондриального чехла, в то же время плазматическая оболочка покрывающей промежуточный отдел хвоста у сперматозоидов баранов-производителей, остается почти без изменений.

К настоящему времени имеется довольно обширная литература о физико-химическом составе гамет и биохимических процессах протекающих в эякуляте сельскохозяйственных животных. Они представлены монографиями Т. Mann [34] и [44], а также работами по отдельным вопросам ряда других авторов. Накоплен значительный материал и по влиянию охлаждения и замораживания-оттаивания на физиологические и биохимические процессы в сперматозоидах сельскохозяйственных животных и человека.

Обширные исследования влияния охлаждения на сперму быка и барана и др., [36] и А. Vоssen, R. Foote [37]) показали, что при этом происходит нарушение активного транспорта ионов. По наблюдениям других авторов нарушение транспортной функции и проницаемости мембраны сперматозоидов проявляется не только в отношении ионов, но и молекул.

[38] указывает, что при быстром охлаждении сперматозоидов быка, наряду со снижением подвижности, происходит резкое снижение (до 60%) содержания фосфолипидов в клетках и увеличение их в плазме в среднем на 12%. В работах целого ряда авторов показано ([39]; [40]; [41]; [42]; [43]) снижение содержания липидов, фосфолипидов и их фракций при охлаждении, особенно после холодового шока и замораживания-оттаивания спермиев (до 11-60%).

и др. [44] отмечают, что при охлаждении сперматозоиды барана и быка теряют аминокислоты, входящие в состав протоплазматических белков. Причем менее устойчивые к действию замораживания сперматозоиды барана теряют их вдвое больше, чем сперматозоиды быка (20% против 11%). По данным [14];[45] охлаждение спермы быка, разбавленной в лактозо-глицериновой среде (ЛГ-среда), не вызывает существенного изменения общего содержания аминокислот. После замораживания-оттаивания наблюдается снижение общего количества аминокислот на 11%. В то же время охлаждение и замораживание спермы баранов в той же лактозо-глюкозной среде вызывает уменьшение аминокислот на 15% и 20% соответственно. Снижение содержания аминокислот наблюдалось и при замораживании-оттаивании сперматозоидов хряков. Эти потери объясняются не только нарушением проницаемости мембраны клеток, но и нарушениями в липопротеидных комплексах. Биохимические исследования показали, что низкие температуры ускоряют распад липопротеидного покрова сперматозоидов, тем самым и их жизнеспособности.

Деструктивные изменения в мембранных структурах сперматозоидов, возникающие после температурного (холодового) шока и замораживания-оттаивания приводят к утечке (выходу) из клеток и высокомолекулярных соединений.

В исследованиях , [46], L. A., Johnson, V. G. Pursel [47], Е. Стшежек и др. [48] и [41]; показано, что после холодового шока и замораживания-оттаивания спермы происходит выход акросомальных ферментов гиалуронидазы и акрозина из сперматозоидов в окружающую среду. При этом снижение активности гиалуронидазы и акрозина находится в зависимости от концентрации глицерина в среде замораживания. С повышением концентрации глицерина снижается сохранность ферментов в сперматозоидах. Поэтапное введение глицерина в среду для замораживания способствует лучшей сохранности гиалуронидазы и акрозина, чем его одномоментное добавление в среду для хранения [48].

Данные реузультаты исследовании [49], Н. Т., Плишко и др. [50], R. A. Harrison, I. G. White [51], M. M. Pase, E. F. Graham [52], [53], [54] и А. С., Ерохина [55]; показали, что замораживание-оттаивание спермы вызывает выход из сперматозоидов в окружающую среду и целого ряда других ферментов: щелочной фосфотазы, каталазы, гексокиназы, альдолазы, цитохромоксидазы, сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, глутаматоксалат трансаминазы, супероксидисмутазы, глюкозо-фосфат изомеразы.

Обширные исследование зависимости функциональной полноценности сперматозоидов после замораживания-оттаивания от выхода ферментов из сперматозоидов, выявило наличие корреляционной связи между сохранностью (утечкой) фермента глутаматоксалаттрансаминазы и качеством сперматозоидов. В частности, со снижением оплодотворяющей способности гамет ([52]; [27]; [16], [56].

Снижение оплодотворяющей способности сперматозоидов после холодового шока и замораживания-оттаивания связано не только с повреждением мембран акросомы, но и значительным сокращением абсолютный показатель живучести сперматозоидов.

По данным [57], [7] и [58]) по сравнению со свежеполученными сперматозоидами, после замораживания-оттаивания абсолютный показатель живучести сперматозоидов быка и барана укорачиваются в 2 и более раза.

1.1.3 Функционирование системы энергообеспечения сперматозоидов

Абсолютный показатель живучести сперматозоидов зависит от функционирования системы энергообеспечения - дыхания и фосфорилирования. T. Mann и E. Leone [59] установили, что при холодовом шоке наблюдается понижение скорости расщепления фруктозы, уменьшение поглощения кислорода и падение концентрации АТФ, синтез которого при этом резко снижается.

Снижение потребления кислорода сперматозоидами лабораторных животных (хомяк, крыса, морская свинка, кролик) после холодового шока наблюдали и другие авторы [60]. И. Иванов [61] также указывает на понижение потребления кислорода заморожено - оттаянной спермой. Хранение замороженного семени при -196° С в течение 12 месяцев не вызывало дальнейшего снижения дыхания. [62] отмечает, что уменьшение количества поглощаемого кислорода сперматозоидами при холодовом шоке связано с понижением числа активных клеток. Сперматозоиды, не утратившие активности после холодового шока, поглощают такое же количество кислорода, как и до воздействия холодовых температур.

Исследования [7] показали, что снижение уровня АТФ в сперматозоидах быков и баранов при их охлаждении до +5-0° С не связано с нарушением механизмов синтеза АТФ, так как после нагревания охлажденной спермы до +18 и +37° С содержание АТФ-АДФ восстанавливается соответственно количеству подвижных клеток. Замораживание сперматозоидов быков и баранов в среде с желтком и глицерином не влияет на дыхание подвижных сперматозоидов быка первые десять минут и барана - 20 минут. В последующем наблюдается снижение дыхания и содержания АТФ, причиной чего являются криогенные повреждения митохондриальных мембран и разобщение фосфорилирования и дыхания.

Важным фактором, усиливающим проявление повреждающего действия охлаждения и замораживания-оттаивания на мембранные структуры сперматозоидов является развитие в них процессов перекисного окисления липидов. В частности [63], , [64] и [65] отмечают, что в норме свободнорадикальное окисление протекает во всех тканях живых организмов и при низкой интенсивности является одним из типов нормальных обменных процессов. В то же время при действии на клетки ряда повреждающих факторов, в том числе и низких температур, процессы перекисного окисления резко усиливаются, что приводит к нарушению функционирования мембранных структур сперматозоидов.

Первые сообщение об образовании токсических продуктов в сперме в результате развития процессов перекисного окисления липидов описано для спермы баранов охлажденной до +5°С L. A. Jonеs и Т. Mann [66] которое затем было подтверждено в других работах [67] и [45] при охлаждении и замораживании-оттаивании спермы быков, хряков и баранов.

Таким образом, при охлаждении и замораживании сперматозоидов возникает ряд ответных реакций физического, физико-химического и биохимического характера, которые приводят к повреждению мембранных структур сперматозоидов и нарушению их основных биологических функций - подвижности и оплодотворяющей способности гамет.

1.1.4 Поиски основных компонентов защитных сред для спермы животных

Сохранность структур и выживаемость сперматозоидов при охлаждении и замораживании-оттаивании существенно зависит от эффективности защитных свойств среды.

Установлены, что основными компонентами среды являются электролиты и неэлектролиты, которые обеспечивают адекватный сперме ионный состав, осмотическое давление и буферную емкость. Это удовлетворяет при разбавлении спермы и хранении ее при комнатной температуре (16...22° С), когда транспорт ионов и неэлектролитных компонентов в системе клетка-среда находится на одном стационарном уровне. Охлаждение, температурный шок, замораживание клеток блокирует активный транспорт ионов и меняет характер и скорость пассивного транспорта в зависимости от соотношения ионов и молекул других компонентов среды. В частности наблюдается выход из сперматозоидов ионов К+ , Мg2+ , а ионы Na+ , Ca2+ , Zn2+ , наоборот накапливаются в избыточном количестве ([34]; [35]; [36]). Такое перераспределение ионов отрицательно сказывается на выживаемости и переживаемости сперматозоидов после замораживания-оттаивания, так как требует большого количества энергии на восстановление необходимого уровня распределения ионов в системе клетка-среда для хранения.