Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 21 )

Таблица 37- Влияние холодового шока и замораживания - оттаивания на содержание сульфгидрильных групп в эякулятах хряков.

Экспериментальное воздействие на эякуляты хряков	Количество SH-групп, мкМ
в 10 млрд. спермиев	в 100 мл плазмы
М+m	%	М+m	%
Свежеполученная	10,3±0,36	100,0	2,4±0,01	100,0
Подвергнутая шоку	8,8±0,28	85,4*	2,3±0,01	95,8
Замороженно- оттаянная без криофилактов	6,2±0,02	60,2**	2,1±0,01	87,5
Свежеразбавленная	12,8±0,87	100,0	-	-
Замороженно - оттаянная с криофилактом	8,5±0,63	66,4**	-	-
* - Р<0,05; ** - P<0,01

По отдельным хрякам-производителям эякуляты подвергнутого к низкотемпературному воздействию, снижение количества сульфгидрильных групп в сперматозоидах колебалось от 14,2 до 15,9%. Замораживание спермы хряков без применение криопротекторов приводило к снижению количественных показателей сульфгидрильных групп в сперматозоидах. Колебания этого показателя по эякулятам хряков составила от 32,1 до 44,9%. В среднем по всем эякулятам хряков производителей. общее снижение содержания сульфгидрильных групп составила - 39,8%.

В плазме спермы хряков также наблюдали уменьшение содержания сульфгидрильных групп в среднем на - 13,7%. По сравнению с исходным уровнем (свежее разбавленная сперма). При замораживания и оттаивания содержание сульфгидрильных групп плазмы спермы в среднем уменьшилось на - 32,8%. Следует отметить, что нами не обнаружено достоверной разницы по снижению содержания сульфгидрильных групп в эякулятах между хряками производителями.

Таким образом, устойчивость сульфгидрильных групп белков половых клеток к повреждающему действию низких температур является более консервативным признаком, не имеющим индивидуальных различий по меньшей мере внутри одной крупной белой породы свиней. Нашт данные свидетельствуют, что одной из причин повреждения клеток при криоконсервации считается окисление сульфгидрильных групп с образованием дисульфидных связей, что приводит к денатурации белков сперматозоидов хряков-производителей.

3.2.5 Изучение роли тиолового фермента лактатдегидрогеназы спермы хряков при криоконсервации

Жизнедеятельность сперматозоидов, как и большинства других клеток, тканей и целого организма может осуществляться только в довольно узком интервале условий внешней среды. Изменение условий окружающей среды всегда приводит к регуляторным изменениям реакций обмена веществ в клетках, задачей которых является приспособление живых организмов к этим изменениям. Регуляция эта обеспечивается благодаря наличию совершенной системы ферментов в каждой клетке.

Повреждающее действие тех или иных факторов на клетки в первую очередь сказывается на функционировании ферментных систем - повышением или понижением их активности на ответ внешнего раздражителя. Поэтому исследование активности ферментов спермы при низкотемпературном воздействии имеет важное значение для выяснения причины и механизмов повреждения половых клеток при их криоконсервации.

В настоящее время для довольно значительного числа ферментов установлено, что субстраты, коферменты или их аналоги оказывают защитное действие по отношению к реа­гентам на сульфгидрильные (SН-) группы, их называют тиоловыми ферментами.

По данным [14] к числу тиоловых ферментов относятся сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы, 3-фосфоглицератдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и многие другие участвующие в важных циклах обмена веществ в клетках.

Дегидрогеназы - это группы ферментов относящихся к классу окисиредуктаз и катализирующие перенос атомов водорода (электронов) непосредственно на кислород или на промежуточный продукт обмена веществ.

В практике искусственного осеменения сельскохозяйственных животных для оценки качество спермы используют метод определения общей активности дегидрогеназ - по времени обесцвечивания метиленового синего. По данным многих авторов, имеется связь времени редукции метиленового синего половыми клетками с активностью движения и резистентностью сперматозоидов [15,16]. В связи с этим нами иссле­довано влияние холодового шока и замораживания-оттаивания на об­щую активность дегидрогеназ в сперматозоидах хряков, при температуре +37 оС (табл. 38).

Анализ таблицы 38 показывает, что резкое охлаждение спермы до +1 +2 °С (холодовой шок) вызывает снижение активности общих дегидрогеназ более чем в 2,5 раза, что выражается соответствующим увеличением времени редукции метиленовой сини. Аналогичное снижение актив­ности дегидрогеназ наблюдается и после замораживания-оттаивания эякулятов хряков. На первый взгляд такое снижение соответствует снижению активности спермы - количеству погибших клеток в результате холодового шока или замораживания-оттаивания. Однако, как видно из таблицы, наблюдается и резкое, более чем в два раза, снижение време­ни живучести выживших после криоконсервации сперматозоидов.

Таблица 38 - Активность, абсолютный показатель живучести (АПЖ) и время редукции метиленовой сини эякулятов хряков

Показатели	Ед. измерения	Сперма
свеже-полученная	после холодового шока	замореженно-оттаянная
Активность сперматозоидов	%	84±4,7	29±3,2	36±4,1
АПЖ сперматозоидов	час	12±2,1	5,8±0,71	4,1±0,66
Общая активность дегидрогеназ	мин.	7,2±0,87	17,5±2,4	21,3±3,7

Если бы снижение актив­ности дегидрогеназ было связано, только со снижением количества вы­живших после криоконсервации половых клеток, то мы не наблюдали бы уменьшения их живучести. Следовательно, снижение общей активности дегидрогеназ может быть связано с выходом ферментов из половых клеток в окружающую среду, а так же инактивацией в результате криогенных изменений мем­бранных структур гамет хряков.

Рядом авторов [163], [170], [171] установлено, что важная роль в регуляции обменных процессов в клетках принадлежит изоферментам лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Известно, что лактатдегидрогеназы катализирует обратное окисление лактата в пируват в присутствии НАД и является, таким образом, фермен­том связующим циклов дыхание и гликолиза. Лактатдегидрогеназы присутствует в большинстве тканей животных в форме 5 изоэнзимов – ЛДГ1; ЛДГ2; ЛДГ3; ЛДГ4; ЛДГ5. Эти изоэнзимы являются тетраметрами, состоящими из двух полипептидных цепей Н и М субъединиц.

Лактатдегидрогеназы I (ЛДГ1) - изофермент, характеризующийся наиболь­шим отрицательным зарядом и наибольшей электрической подвиж­ностью, состоит из Н субъединиц, а лактатдегидрогеназы 5 (ЛДГ5) - изофермент. состоящийся из М субъединиц. Остальные изоферменты представляют собой сочетание обоих - Н и М субъединиц. Соотношение между изоферментами сильно варьирует для разных тканей и видов животных, но для каждой ткани животных строго постоянная величина.

Изменение активности и особенно соотношение изоферментов лактатдегидрогеназы является показателем тех или иных из­менений в функционировании клеток и тканей животных. В тканях животных с выра­женным аэробным обменом (сердце, почки) преобладают "быстрые" изоферменты ЛДГ1 и ЛДГ2 , а в тканях с анаэробным обменом - "медленные" формы ЛДГ4 и ЛДГ5 , что связано с различной функцио­нальной ролью Н и М субъединиц, отличающихся по ферментативным свойствам и активностью.

Регуляторная роль, которая отводится изоферментам лактатдегидрогеназы, связана с поддержанием в тканях животных определенного соотношения аэробного и анаэробного обмена веществ. В частности установлено, что в регуляции соотношения аэробного и анаэробного обмена веществ при оплодотворении важную роль играют изоферменты лактатдегидрогеназы.

Исследование изоферментного спектра лактатдегидрогеназы свежеполученной спермы хряков показало наличие всех пяти изоферментов, характеризующихся различной электрофоретической по­движностью, зарядом и активностью. Изофермент ЛДГ1 об­ладает наибольшим отрицательным зарядом и электрофоретической подвижностью (100%) по направлению к анодному заряду. Подвижность ЛДГ5 в сторону анода не наблюдается. Наши исследования показали что, процентное соотношение изоферментов в экстракте из сперматозоидов и в плазме в определенной степени различаются (табл. 39).

Таблица 39- Соотношение изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сперме хряков

Сперма	Количество изоферментов	ЛДГ5 ЛДГ1	ЛДГ3 ЛДГ1
ЛДГ1	ЛДГ2	ЛДГ3	ЛДГ4	ЛДГ5
Не разбавленные сперматозоиды	8,3	4,8	24,6	38,7	26,1	2,9	2,9
Разбавленные сперматозоиды	10,2	3,3	16,3	24,3	49,3	4,8	1,6
Не разбавленная плазма	17,3	15,6	29,9	32,3	8,1	0,5	1.7
Разбавленная плазма	15,8	13,8	21,0	26,4	24,7	1,6	1,3

Хотя сперматозоидам хряка более характерен аэробный гликолиз доля "аэробных" изоферментов ЛДГ1 и ЛДГ2 значительно мень­ше чем "анаэробных". Как видно из таблицы 40, в половых клетках и плазме нативной спермы хряков наибольшая доля количества фермента приходится на ЛДГ4 и составляет соответственно 38,7% и 32,3%. Остальные изоферменты эякулятов хряков распределяются в следующем порядке: спер­матозоиды – ЛДГ1 - 8,3%; ЛДГ2 - 4,8%; ЛДГ3 – 24,6%; ЛДГ5 – 26,1%; плазма – ЛДГ1 - 17,3%; ЛДГ2 - 15,6%; ЛДГ3 - 29,9% и ЛДГ5 - 8,1%. Активность ЛДГ5 в сперматозоидах значительно (более чем в 2,9 раза) превы­шает активность изофермента в плазме спермы.