Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 15 )

Влияние унитиола на скорость движения сперматозоидов представлено в таблице 15.

При добавлении к сперме унитиола в концентрации 6,7·10-4 М в начальном периоде наблюдается некоторое снижение скорости движения сперматозоидов. Однако, в дальнейщем скорость достоверно повышается и в течение 6 часов остается на постоянном уровне, к 9 часам инкубации приближается к контролю и поддерживается на этом уровне более двух суток.

Полная потеря подвижности в присудствии унитиола наблюдается только после 60-61 часов инкубации, а в контроле - после 29-30 часов. Унитиол в концентрации 1,7·10-2 М стимулирует скорость движения в течение первых 6 часов инкубации, затем наступает снижение скорости, а через 12 часов инкубации все сперматозоиды становится неподвижным. Во всех случаях повышение или снижение скорости движения сперматозоидов унитиолом или окисленным глутатионом статистически достоверны (Р 0,05-0,001).

Тиоловые соединения – унитиол, восстановленный глутатион, цистеин, β-меркаптоэтанол, дитиотреитол в низких концентрациях повышает скорость движения сперматозоидов хряков от 12,1 до 35,4% и сохраняют такое активность на уровне свежеполученного состояния от 3 до 6 часов (рис. 2).

Таким оброзом, добавление к сперме сцефических толовых реагентов на сульфгидрильные группы позволяют удинить сроки активного движения половых клеток и тем самым и более быстрого достижения к яйцелетке самок.

Таблица 15- Влияние унитиола на скорость движения сперматозоидов (мкм/с)

Срок инкубации спермы (час)	Контроль	Концентрация унитиола (М)
6,7∙10-4	1,7∙10-2
Количество спермиев	Скорость м/сек	Количество спермиев	Скорость м/сек	Количество спермиев	Скорость м/сек
0 1 3 6 9 12 24 30 36 48 60 72	251 215 234 237 159 191 38 29 - - - -	83 70 76 76 63 59 36 18 - - - -	220 210 217 251 177 212 191 88 78 72 13 -	78* 86** 85** 85** 66** 61** 58*** 56*** 57 55 19 К	111 99 116 114 109 53 - - - - - -	100** 100** 113*** 102*** 76*** 17*** - - - - - -
Примечание: * - Р<0,05; ** - P<0,01; *** - P<0,001

Использование оптимальных концентрации некоторых изученных тиоловых реагентов совместно с другими известными криопротекторами, позволить разработать новую среду для долговременнго хранения спермы хряков.

3.1.6 Исследование влияние тиоловых соедиений на сохранность акросом сперматозоидов хряков

Головка сперматозоидов животных содержит ядро, акросому и цитоплазму. Акросома покрывает в виде колпачка передние 2/3 ядра и содержит набор гидролитических ферментов, необходимых для оплодотворения яйцеклетки и начальных этапов развития эмбрионов: гиалуронидазу, трипсиноподобную протеиназу (акрозин), щелочную и кислую фосфотазу, β-глюкоронидазу, β-амилазу.

Гидролитические ферменты акросомы осуществляют гидролиз лучистого венца яйцеклетки и способствуют проникновению сперматоизоидов через зону pellucid в яйцеклетку.

Рисунок 2- Влияния тиоловых соединений на скорость движения сперматозоидов хряков

Акросома в сравнении с другими структурами сперматозоидов более насыщен водой, что является одной из причин ее высокой чувствительности к хранению, охлаждению и замораживанию.

Учитывая эти особенности акросомы нами изучены влияния различных тиоловых соедиений на сохранности акросомы свежеполученной и храненной в условиях температуры +18 0С спермы хряков. Полученные данные приведены на рисунке 3.

Анализ рисунка 3 показывают, что в целом тиоловые соедиенеия в низких концентрациях способствует сохранности акросом сперматозоидов по сравнению с контрольными образцами эякулятов. Но более положительные влияния на акросомы спермиев повлияли два реагента: унитиол и дитиотреитол. Так при хранении спермы в условиях комнотной температуры до 9 часов, сохранность акросом в унитиоле составила -86,6-80,9%, а в дитиотреитоле - 85,3-76,8%. С этими двумя реагентами акросомы сперматозоидов в течение 6-7 часов практически остаются на уровне свежеполученного эякулята.

Таким образом, добавление к сперме унитиола и дитиотреитола способствуют сохранение целостности одного из главных структурных элементов акросом сперматозоидов, которая в своем составе содержит гидролитических ферментов играющих ключевых роли в оплотворения яйцеклеток.

3.1.7 Исследование влияние востановленного глутатиона и унитиола на оплодотворяющую способность спермы хряков

Учитывая возможности количественного ограничения животных из тиоловых соединенеий исследованны востановленный глутатион и унитиол. Для изучения влияния востановленного глутатиона и унитиола на оплодотворяющую способность неразбавленной спермы хряков, сохраняемой при комнатной температуре, использовано 46 эякулятов, взятых от 4 хряков. Этими эякулятами искусственно, однакратно осеменено 140 основных свиноматок, от которых получено 1330 просят. В среднем на основную свиноматку 9,5 поросят. Из общего количества поросят к 2месячному возрасту осталось 1284 голов. Сохранность поросят – 95,5%.

Результаты опытов представлены в таблицах 16 и 17. Контролем служили группы 1,2,3,4,5, в которых использовали неразбавленную сперму без добавки унитиола или востановленного глутатиона, а также группа №12, свиноматок которой осменяли по методике, принятой в совхозе, т. е. свежеполученной спермой, разбавленной молочным разбавителем. Доза спермы и в этом случае имела объем 150 мл и содержала 5 млрд. Поступательно-подвижных сперматозоидов.

Анализ этих таблиц показывает. что хранение неразбавленной спермы при комнатной температуре приводит к снижению оплодотворяющей способности сперматозоидов и плодовитости свиноматок. Так, после 5 часов только 30%, а после 15 часов всего – 10%. Полная потеря оплодотворяющей способности сперматозоидов наблюдается после 20 часов хранения спермы. Так после 5 часов хранения спермы получено в среднем 10,2 поросят на опорос, после 10 часов хранения – 8,7, а после 15 часов – 7,0 поросят.

Рисунок 3- Влияния тиоловых соединений на сохранности акросом сперматозоидов

Таблица 16- Влияние унитиола и востановленного глутатиона на оплодотворя-щую способность спермы

№ группы	Добавка в сперму	Срок хранения спермы (час)	Процент подвижных сперматозоидов	Осеменено свиноматок	Оплодот-ворилось свиноматок	Процент оплодот-ворения
1 2 3 4 5	- - - - -	свежеполуч. 5 10 15 20	85 59 43 23 6	10 10 10 10 10	9 6 3 1 -	90 60 30 10 -
6 7 8 9 10	унитиол унитиол унитиол унитиол унитиол	свежеполуч. 5 10 15 20	85 85 78 68 52	10 10 10 10 10	9 10 9 9 8	90 100 90 90 80
11 12 13	вос. глутатион вос. глутатион вос. глутатион	свежеполуч. 5 10	71 42 13	10 10 10	8 3 1	80 30 10
14	молочный разбавитель	свежеполуч.	80	10	9	90

Оплодотворяемость свиноматок, осемененных спермой, хранившейся 10-15 часов в присутствии унитиола, состовляет 90%. Нормальная оплодворяемость и плодовитость обнаружены также у свиноматок, которых осменяли спермой, инкубированной с унитиолом в течение 20 часов, хотя это сперма имела только 53% поступательно-подвижных сперматозоидов. Согласно инструкции по искусственному осеменению свиней к осеменению допускается сперма содержащая не менее 60% поступательно – подвижнцых сперматозоиов.

Живая масса поросят в возросте одного и двух месяцев, а также отход поросят до двухмесячного возроста были практически одинаковыми как в опытах, так в контрольных группах.

Добавление к сперме хряков-производителей востановленного глутатиона в концентрации 2·10-6 М и инкубация с ним в течение 1 часа не влияли на оплодотворяющую способность сперматозоидов и на плодовитость свиноматок, но продолжительное хранение (5-10 часов) отрицательно влияют на сохранности оплодотворяющую способность сперматозоидов.

Таблица 17 - Влияние унитиола и востановленного глутатиона на качество потомства

№ группы	Получено всего поросят (гол)	Получено поросят на опорос	В том числе хрячков (%)	Средний вес животных в возрасте	Получено поросят на свиноматкгу при отьеме (гол)	Отход поросят до 2х мес. Возроста (%)
При рождении	1 месяц	2 месяц
1 2 3 4 5	99 61 26 7 -	11,0 10,2 8,7 7,0 -	51,0 50,0 50,0 57,1 -	1,13 1,17 1,16 1,20 -	7,1 6,9 7,2 - -	15,8 16,1 17,0 17,1 -	10,3 9,5 8,3 7,0 -	6,4 6,9 4,6 - -
6 7 8 9 10	99 110 98 100 84	11,0 11,0 10,9 11,1 10,5	51,0 48,2 48,6 46,9 46,4	1,15 1,17 1,21 1,18 1,16	7,5 6,9 7,1 7,6 7,4	16,5 16,9 17,2 16,9 16,8	10,4 10,3 10,2 10,5 10,0	5,4 6,4 6,4 5,4 4,8
11 12 13	81 96 -	9,2 8,7 -	51,2 50,9 -	1,17 1,19 -	7,6 7,2 -	17,0 16,6 -	9,6 10,0 -	5,1 6,5 -
14	Молочный разбавитель	76	39	1,12	7,1	16,3	9,5	7,5

Так при хранении спермы с востановленным глутатионом в течение 5 часов оплодотворяемость свиноматок составила 42%, а при 10 часов всего лишь 13% (табл. 16). Как указано в таблице 17, при этом замечено и снижение многоплодности свиноматок в среднем на 11% и более