Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 2 )

АДФ - аденозиндифосфат

ЛДГ –лактатдегидрогеназа (ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5 )

ДТИ – дитиотреитол

SН – сульфгирильные группы

ВНИИГРЖ – Всероссийский научный исследовательский институт генетики и разведения животных

ВАСХНИЛ – Всероссийская Академия сельскохозяйственных наук имени Ленина

ОЕР - детергент S-амино-Na-лаурилсульфата

СРО - свободнорадикальное окисление

ПОЛ - перекисное окисление липидов

АСТ - аспаргиновые трансаминазы

АЛТ - аланиновые трансаминазы

ОЕР - S-амино - Na-лаурилсульфат детергент

ВП - время переживания

ОС - оплодотворяющая способность

ЦХО - цитохромоксидаза

АПЖ – абсолютный показатель живучести

ГЦДУ - глюкозо-цитрато-дитиотреитол-унитиол

ГХЦ - глюкозо-хелато-цитрат

ГХЦС-8- глюкозо-хелато-цитратовая среда-8

ГХЦЖК - глюкозо-хелато-цитрат-желточно-калий

ГХЦЖКМ - глюкозо-хелато-цитрат-желточно-калий-мочквина

ГХЦЖКУМ - глюкозо-хелато-цитрат-желточно-калий-унитиол-мочевина

ГЦДУМЖ - глюкозо-цитрато-дитиотреитол-унитиол-мочевино-желточная

ГД - гемпшир – дюрок

ГОТ – глутаматоксалаттрансаминаза

ВВЕДЕНИЕ

Общая характеристика работы. Диссертация по уровню принадлежит к научно-техническим разработкам имеющих ценность к животноводству, в частности свиноводству, теоретические и практические выводы будут интересны ученым работающим с криобиологией клеток.

Актуальность темы. Взятый курс правительства Республики Казахстана по улучшению селекционно-племенной работы ведения животноводства невозможна без применения такой прогрессивной биотехнологии в разведении животных, как искусственное осеменение с использованием храненной и глубокозамороженной спермы.

Успешная разработка методов низкотемпературной консер­вации биологических объектов невозможна без глубокого по­знания причин и механизмов повреждения и устойчивости кле­ток и организмов при охлаждении и замерзании.

Лишь после работ русских ученых [1], что при замораживании мы имеем дело не с прекращением жизни, а с предельным ее за­медлением в результате подавления метаболических реакций. Это состояние было названо анабиозом при замерзании. Ана­биоз - переход в состояние покоя - является приспособитель­ной реакцией клеток и организма к неблагоприятным усло­виям, которая возникла как первичное свойство организмов в период зарождения жизни на Земле и развилась в процессе их эволюции. Способность спермиев теплокровных животных сохранять жизнеспособность в замороженном состоянии пред­ставляет один из замечательных примеров полного анабиоза клеток.

Работы положили начало тео­рии замерзания биологических объектов. Им впервые было дано теоретическое объяснение закономерностей криоанабиоза при обезвоживании организма в результате переохлаждения и замерзания воды в клетках. Показано, что переохлаждение или понижение температуры жидкости ниже точки ее замерзания до критической температуры играет существенную роль в со­хранении жизнеспособности клеток. Дальнейшие исследования показали, что процесс замораживания - оттаивания в целом определя­ется физико-химическими свойствами воды, ее особым поведе­нием при понижении температуры, тогда как на процесс кристаллизации и таяния льда влияют характер объекта, состав биологической жидкости и скорость охлаждения.

Сведения о структуре воды являются ключом для понима­ния процессов, которые происходят при охлаждении и замора­живании. Способность воды переохлаждаться в капиллярах до -30..- 80°С объясняется ее связыванием капиллярными си­лами и увеличением упорядоченности структуры. При темпера­туре около 0°С вода принимает нестабильную «льдообразную» структуру, обладающую центрами, вокруг которых образуются кристаллы. Механический удар, загрязнение способствуют вне­запной кристаллизации. Напротив, кипячение разрушает цен­тры кристаллизации, разупорядочивает структуру. Установ­лено, что растворы солей, сахара, глицерина как бы скрепляют решетку и дольше сохраняются в переохлажденном состоянии.

Фазовый переход воды из жидкого состояния в твердое про­исходит в широкой температурной зоне - от 0 до -80°С. В этой зоне вода принимает жидкокристаллическое состояние. Замерзая, она образует кристаллы гексагональной формы, при этом выделяется скрытая теплота кристаллизации. Форма кристаллов зависит от температуры, скорости ох­лаждения и состава раствора. Если скорость замораживания настолько высока, что молекулы воды не успевают переместиться и образовать кристаллическую решетку, вода переходит не в кристалличе­ское, а аморфное состояние или превращается в стеклообраз­ный лед. Это явление получившее название витрификации, или аморфизации.

Открытие витрификации сыграло чрезвычайно большую роль в разработке методов низкотемпературной консервации спермы, так как некристаллическое замерзание мало повреж­дает клетки и сохраняет их жизнеспособность. Однако оно про­исходит лишь при очень высоких скоростях охлаждения, по­рядка 5000°С/с, что практически не достижимо. Кроме того, было показано, что стекловидное состояние неустойчиво: начи­ная с температуры -100°С происходят образование и укруп­нение кристаллов. Это явление называют рекристаллизацией при оттаивании, или миграционной кристаллизацией. Рекри­сталлизация губительна для половых клеток самцов. Стекловидное состояние можно сохранить при температуре ниже -130 °С. Это обстоя­тельство побудило ученых обратиться к поиску защитных ве­ществ, которые бы способствовали некристаллическому замер­занию.

Теоретические исследования в криобиологии спермы животных открыли большие перспективные возможности не только в ускоренном развитии и широком внедрении методов искусственного осеменения сельскохозяйственных животных, но и в сохранении генетически наиболее ценных и исчезающих пород и видов животных.

Успешная разработка методов низкотемпературной консервации спермы животных невозможна без глубокого познании причин и механизмов повреждения и устойчивости спермы при охлаждении и замерзании. Известно, что в процессах клеточного дыхания, реакциях окислительного фосфорилирования важную роль играют низкомолекулярные тиоловые соединения, содержащие сульфгидрильные группы (SН-). Они входят в активные центры многих ферментов и коферментов, а также участвуют в поддержании третичной структуры белков клеток.

В свиноводстве страны методоы искусственного осеменения применяют только лишь в нескольких хозяйствах, а разработкой технологии криоконсервировации эякулятов вообще не занимаются. Это связано с биологическими особенностями низкой криоустойчивости спермы хряков, необходимостью замораживания значительно больших объемов спермы, технологическими и методическими трудностями нестабильностью результатов осеменения. Поэтому проблема совершенствования метода криоконсервации спермы хряков и поиск подходов и способов повышения криоустойчивости сперматозоидов остается весьма актуальной.

Исследования по совершенствованию биотехнологии хранения половых клеток в нашей стране не ведутся, а в странах с развитым свиноводством вопросами криоконсервации спермы хряков занимаются. Для обсуждения полученных результатов и установление научных связей материалы диссертации излагались в конференциях России, Польши, Болгарии, Белоруссии, Чехии и на Мальдивах.

На современном этапе развитии искусственного осеменения в свиноводстве актуальны изучения изменении количества сульфгидрильных групп в плазме спермы и сперматозоидов хряков при охлаждении и замораживании-оттаивании, выявление между содержанием SН-групп в свежеполученной сперме и функциональной полноценностью заморожено-оттаянной спермы, а также поиски путей повышения криоустойчивости эякулятов хряков. В связи с этим разработка сред с использованием тиоловых соединений для кратковременного и долговременного хранения спермы имеет научную ценность, а полученные результаты являются инновационными.

Решение биотехнологической проблемы по дальнейшему совершенствованию кратковременного и долговременного хранения спермы хряков приведет к использованию высокоценных, отценных по селекционно-генетическим параметрам хряков-производителей, избежать близкородственного спаривания, повышению воспроизводительных качеств свиноматок, увеличению темпа роста молодняка свиней, а также более широкого внедрения прогрессивного метода - искусственного осеменения маточного поголовья.

Научно-исследовательская работа по данной теме является составной частью исследований кафедры «Биотехнологии» Южно-Казахстанского государственного университета имени М. Ауезова по теме «Разработать биотехнологические методы по долговременному хранению генофонда животных».

Цель исследований является разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков, путем изучения взаимосвязи между содержанием сульфгидрильных групп и качеством эякулятов, влияние добавленного тиолового соединение на сохранности функциональных показателей при кратковременном хранении и криоустойчивости замороженно-оттаянной спермы.

Объектом исследования являются свиньи крупной породы в свиноводческих хозяйствах «Достык», «Дидар» и «Аксункар» Южно-Казахстанской области. Ряд анализов проведены в специализированных лабораториях Всероссийского НИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных – Россия; в лабораториях Южно-Казахстанского государственного университета имени М. Ауезова.

Задачи исследований:

- изучить количественные показатели сульфгидрильных групп в плазме и сперматозоидах, определить их роль в хранении функциональной полноценности половых клеток;

- изучить влияние тиоловых соединений на изменение окислительного фосфорилирования в сперматозоидах и качественные показатели при кратковременном и долговременном хранении эякулятов;

- изучить влияние тиоловых реагентов на ферментативную активность спермы - дегидрогеназную, цитохромоксидазную и изоферментный спектр лактатдегидрогеназы;

- разработать новые эффективные среды пригодных для кратковременного (+ 2 – 0 0С) и долговремененного хранения спермы хряков (-196 0С);

- провести осеменения свиноматок со спермой, храненной с новыми разбавителями и оценить качество полученного потомства;

- определить экономическую эффективность применения новых сред для спермы хряков.

Научная новизна. Полученные нами данные экспериментальных исследований позволили: развить имеющиеся знания по криобиотехнологии сперматозоидов; показать взаимосвязи между содержанием сульфгидрильных групп и качеством эякулята; степень важности тиоловых соединений в механизмах ферментативного регулирования энергетического обмена и криоустойчивости сперматозоидов.