Общие методы анализа (стр. 30 )

В случае работы с анионитом его для перевода в основную форму после отмывки от хлористоводородной кислоты водой заливают 5% раствором карбоната натрия или 2% раствором едкого натра на 2 ч (во время выдержки необходимо периодическое перемешивание). Эту операцию повторяют до получения отрицательной реакции сливаемого раствора на хлориды. Обработку раствором щелочи следует производить в условиях, исключающих поглощение углекислого газа из воздуха.

Подготовленные иониты промывают водой и сливают в колонку, заполненную на 3/4 водой. Избыток воды сливают из колонки через кран. Из слоя ионита пузырьки воздуха удаляют осторожным встряхиванием колонки или обратным током воды. Заполненную колонку промывают до нейтральной реакции, следя за тем, чтобы сорбент постоянно находился под слоем жидкости. Если ионит всплывает, над его слоем необходимо поместить тампон из стеклянной ваты.

Хроматографирование проводят, пропуская анализируемый раствор через колонку. Процесс завершается промыванием колонки.

Количество продуктов ионного обмена, содержащееся в смеси прошедшего через колонку анализируемого раствора и промывочной жидкости, эквивалентно количеству адсорбированных на колонке катионов или анионов анализируемого раствора. Это позволяет проводить количественные определения прямым титрованием продуктов ионного обмена. В случае хроматографирования на ионите, находящиеся в Н - или ОН-форме, продукты ионного обмена титруют соответственно основными или кислыми титрантами.

Как правило, возможно многократное использование ионообменной хроматографической колонки. Если в частной статье не указано иначе, регенерацию катионитов и анионитов после проведения ряда определений осуществляют, пропуская через колонку соответственно 4% раствор хлористоводородной кислоты или 5% раствор карбоната натрия (2% раствор едкого натра). По окончании процесса, когда концентрации регенерирующего раствора на входе и выходе из колонки становятся равными, ее промывают водой до нейтральной реакции.

КонсультантПлюс: примечание.

Приказом Минздрава России от 01.01.2001 N 771 взамен настоящей фармакопейной статьи введена в действие с 1 января 2016 года ОФС.1.2.1.2.0002.15.

ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ

Хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной жидкой фазы, называется хроматографией на бумаге.

Неподвижной фазой является либо сама бумага, либо вещества, предварительно нанесенные на ее волокна. Механизм хроматографии на бумаге бывает распределительным или адсорбционным. Перемещение подвижной фазы осуществляется либо исключительно под действием капиллярных сил (восходящая хроматография), либо под действием капиллярных сил и силы тяжести (нисходящая хроматография).

При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бумаге круглые или овальные пятна (зоны). Совокупность пятен, полученных при хроматографировании данного анализируемого образца, называется хроматограммой.

Подвижности вещества при хроматографировании характеризуются величиной Rf, представляющей собой отношение средних скоростей перемещения вещества и подвижной фазы за время получения хроматограммы. На экспериментально определяемые значения Rf заметно влияют условия хроматографирования. Более точной оценкой хроматографической подвижности, мало чувствительной к влиянию случайных отклонений в условиях проведения эксперимента, является величина Rs, представляющая собой отношение величины Rf одного вещества к величине Rf другого вещества, принятого за стандарт. Обычно выбор стандарта осуществляют так, чтобы величины Rs лежали в пределах 0,5-2. Величины Rf и Rs используют для ориентировочной идентификации веществ. Подлинность определяется при одновременном хроматографировании на одном листе бумаги анализируемого и аутентичного образца одного и того же вещества. Если образцы идентичны, соответствующие им пятна на хроматограммах имеют одинаковый вид и равные значения Rf. Для цели идентификации иногда целесообразно хроматографировать смесь равных количеств анализируемого и аутентичного образцов данного вещества. На хроматограмме должно наблюдаться одно пятно. Условия хроматографирования следует подбирать так, чтобы значения Rf были отличны от 0 и 1.

При испытаниях на чистоту примеси и основное вещество в условиях хроматографирования должны иметь разные значения Rf. При этом условии можно судить о степени чистоты анализируемого вещества по величине и интенсивности окраски обнаруживаемых на хроматограмме пятен примесей. Содержание примесей может быть определено полуколичественно. Для этого на одном листе бумаги одновременно получают хроматограмму определенного количества анализируемого вещества и несколько хроматограмм образца определяемой примеси (свидетеля), взятого в различных, точно отмеренных количествах. Содержание примеси в анализируемом образце оценивают, сравнивая ее пятно на хроматограмме по совокупности величины и интенсивности окраски с пятнами свидетеля. При достаточном сходстве пятен примеси по форме и окраске с пятнами основного вещества, взятого в том же количестве, допускается использование соответствующих количеств основного вещества в качестве свидетелей при хроматографировании. Количественное определение веществ после хроматографического разделения проводится денситометрически непосредственно на хроматограмме либо после элюирования. В последнем случае пятна вырезают и после измельчения извлекают определяемое вещество из бумаги каким-либо подходящим растворителем. Содержание анализируемого вещества в извлечении или сухом остатке, после отгонки растворителя находят любым методом, пригодным для определения малых количеств (спектрофотометрия, полярография и т. д.).

Оборудование

Для проведения хроматографии на бумаге используют герметизированные камеры, изготовленные из инертного материала. Часто в качестве камер используют стеклянные банки, закрывающиеся пришлифованной крышкой. Внутри камеры в верхней или нижней ее части помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку).

Лодочка должна вмещать объем подвижной фазы, достаточный для проведения однократного хроматографирования. Длина лодочки должна превышать ширину листа хроматографической бумаги. Камера должна быть снабжена устройствами для закрепления листа хроматографической бумаги в рабочем положении и для ввода в лодочку подвижной фазы.

Внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, что способствует более быстрому и полному ее насыщению парами растворителей, применяемых при хроматографировании.

Подготовка фаз и бумаги

При приготовлении несмешивающихся систем растворителей, совместно используемых при хроматографии в качестве подвижной и неподвижной фаз, необходимо обеспечить их взаимное насыщение, например, путем встряхивания в делительной воронке.

Фильтровальную бумагу нужной плотности квалификации "для хроматографии" разрезают в направлении, перпендикулярном или параллельном волокнам, на листы (полосы), длина которых приблизительно равна высоте камеры. Ширина этих полос может быть приближенно определена по формуле: А = 3(К + 1), где А - ширина полосы (см), К - количество хроматограмм на полосе.

На каждой полосе бумаги для обозначения места нанесения хроматографируемых веществ графитовым карандашом проводят прямую линию, называемую линией старта. Расстояние от конца полосы бумаги до линии старта выбирается так, чтобы при погружении бумаги в лодочку исключалось непосредственное соприкосновение нанесенных на линию старта веществ с жидкостью, находящейся в лодочке.

На приготовленные таким образом листы хроматографической бумаги, если указано в частной статье, наносят неподвижную фазу. Для этого соответствующие труднолетучие растворители (формамид, пропиленгликоль и т. п.) смешивают с легколетучими растворителями (обычно с метиловым спиртом) и в полученную смесь на 1-2 с погружают подлежащие обработке листы бумаги. Избыток смеси с поверхности листов снимают, обжимая их между двумя слоями фильтровальной бумаги, после чего летучий компонент смеси удаляют высушиванием на воздухе в течение 15-20 мин.

Если в качестве неподвижной фазы рекомендован водный раствор нелетучих веществ, то бумагу обрабатывают этим раствором, высушивают, как указано выше, а перед хроматографированием выдерживают в камере, содержащей пары воды. Нанесение на бумагу легколетучих компонентов неподвижных фаз осуществляется путем выдерживания ее в парах фазы в камере непосредственно перед хроматографированием.

Методика хроматографического разделения

Нисходящая хроматография

На дно хроматографической камеры помещают неподвижную или подвижную фазу в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 2,5 см. Камеру закрывают и оставляют для насыщения на 24 ч при постоянной температуре. В отдельных случаях, при использовании достаточно летучих растворителей, это время может быть сокращено.

Растворы веществ наносят на линию старта микропипеткой или микрошприцем так, чтобы расстояние между точками нанесения отдельных проб было не менее 3 см. Если минимально необходимое для проведения хроматографирования количество анализируемого раствора может образовывать на бумаге пятно, превышающее в диаметре 10 мм, нанесение проводят в несколько приемов, предотвращая путем подсушивания чрезмерное растекание пятна на линии старта. После нанесения растворов анализируемых веществ и высыхания образовавшихся при этом пятен полосу бумаги закрепляют в рабочем положении в камере и оставляют на 1,5 ч. В рабочем положении полоса хроматографической бумаги должна висеть вертикально так, чтобы между ее верхним концом, погруженным в лодочку, и линией старта был лишь один, по возможности плавный, перегиб. По окончании выдержки начинают хроматографирование, для чего в лодочку вливают подвижную фазу. Хроматографирование обычно заканчивают при приближении фронта подвижной фазы к нижнему концу полосы бумаги. Если в частной статье нет специальных указаний, полосу вынимают из камеры и высушивают на воздухе, отметив графитовым карандашом конечное положение подвижной фазы. Пятна открывают как указано в частной статье.

Восходящая хроматография

Для проведения восходящей хроматографии на бумаге используют камеры, в которых сосуд (лодочка) с подвижной фазой располагается в нижней части или на дне. Полоса хроматографической бумаги закрепляется в верхней части камеры так, чтобы обеспечить возможность погружения нижнего конца полосы в лодочку с подвижной фазой. В рабочем положении полосы линия старта должна отстоять от поверхности подвижной фазы на 2-3 см. В остальном приемы работы при проведении восходящей хроматографии на бумаге не отличаются от описанных выше.