Общие методы анализа (стр. 33 )

Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и проведения количественного и качественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так и с большой молекулярной массой.

Основными узлами современного жидкостного хроматографа являются: насос высокого давления, дозатор, высокоэффективная колонка, детектор с регистрирующим устройством.

Современные жидкостные хроматографы могут быть снабжены микропроцессором и устройствами, с помощью которых можно автоматически производить ввод пробы, поддерживать условие хроматографического процесса по заданной программе, автоматически оптимизировать условия разделения, проводить расчет количественного состава анализируемой смеси по одной или нескольким программам и проводить качественный анализ.

Насос высокого давления (до 200-500 атм) обеспечивает подачу элюента в колонку с заданной постоянной скоростью. В некоторых микроколоночных хроматографах применяются насосы сравнительно низкого давления (до 10-20 атм).

Хроматографические колонки из нержавеющей стали (или из стекла) длиной 10-25 см с внутренним диаметром 0,3-0,8 см (чаще 0,4-0,5 см) заполняются адсорбентом с диаметром частиц 5-10 мкм сферической или неправильной формы с помощью суспензионного метода, что дает возможность получить более равномерную и плотную упаковку частиц сорбента в колонке. Заполнение колонки проводится при больших давлениях, чем рабочее давление в хроматографе. В микроколоночных хроматографах используются колонки меньшей длины и меньшего внутреннего диаметра (0,1-0,2 см и меньше).

Частицы адсорбента не должны разрушаться при заполнении колонки под большим давлением.

Плотная упаковка частиц адсорбента малого диаметра (5-10 мкм) в колонке позволяет получить высокоэффективное хроматографическое разделение компонентов смеси. Температура хроматографических колонок может поддерживаться с точностью +/-0,1 град. С в интервале, ограниченном температурой замерзания и кипения элюента. Чаще всего разделение проводят в интервале температур 20-50 град. С.

В качестве детекторов в жидкостной хроматографии обычно используют спектрофотометрический детектор с переменной (190-900 нм) или фиксированной (чаще при 254 нм) длиной волны, рефрактометрический или флуориметрический детекторы. Могут быть использованы и другие детекторы, например ионизационно - пламенный, электрохимические, масс - спектрометрический и т. д.

В качестве адсорбентов чаще всего применяют силикагель с гидроксилированной поверхностью и силикагель с привитыми к поверхности различными функциональными группами, реже используются окись алюминия и полимерные адсорбенты. На практике обычно применяют готовые колонки.

При работе с колонками, заполненными силикагелем, в качестве элюента используют углеводороды, иногда с добавлением небольшого количества спирта или других растворителей. В обращеннофазной хроматографии применяют колонки, заполненные силикагелем с привитыми гидрофобными группами, и в качестве элюента - водные растворы, содержащие низшие спирты или ацетонитрил. Во многих случаях не требуется дополнительная очистка растворителей, но иногда тщательная очистка растворителей необходима.

Для разделения органических соединений в виде солей, а также кислот и оснований применяют ион - парную хроматографию. В этом случае применяют адсорбенты с привитыми гидрофобными группами, а в элюент, обычно водно - спиртовой или водно - ацетонитрильный, добавляют ионные соединения, анион или катион которых содержит гидрофобную группу.

Для разделения органических катионов или анионов применяют ионнообменную жидкостную хроматографию. В этом случае разделение проводят на адсорбентах с сульфо - или карбоксильными группами и замещенными или незамещенными аминогруппами различной основности, а в качестве элюента - водные буферные растворы с соответствующими рН и ионной силой.

Для разделения веществ, способных образовывать комплексы с катионами металлов, в частности для разделения оптических изомеров аминокислот, используют лигандообменную хроматографию, в которой разделение основано на различии в способности анализируемых веществ образовывать координационные связи в координационной сфере присутствующего в системе комплексообразующего иона металла. В этом случае применяют адсорбенты, на поверхности которых имеются группы, способные образовывать комплексы с ионами металлов и разделяемым веществом.

  Для характеристики и  разделения высокомолекулярных соединений

  3

(молекулярная масса выше 10 )  применяют  эксклюзионную  (ситовую)

хроматографию, которая  обеспечивает  разделение  веществ  в

соответствии  с  размерами  их  молекул.  В  качестве  адсорбентов

используют гидроксилированные силикагели с различным диаметром пор

или  аналогичные  силикагели  с  привитыми  диольными  и  другими

группами, а также различные гели.

Степень разделения веществ в колонке определяется расстоянием между максимумами двух соседних пиков и шириной хроматографической полосы. Расстояние между максимумами зависит от селективности адсорбента по отношению к разделяемым веществам, а ширина полосы - от эффективности колонки, которая определяется характером упаковки частиц адсорбента, вязкостью элюента, размыванием в соединительных узлах и детекторе. Высокоэффективная колонка способна разделять вещества и при малой селективности адсорбента.

Для определения содержания каждого компонента в смеси необходимо провести количественную оценку хроматограммы с использованием методов абсолютной калибровки или внутреннего стандарта (см. раздел "Газовая хроматография").

Если примеси близки по строению, то качественно их содержание можно оценить по соотношению пиков на хроматограмме. Однако если чувствительность детектора по отношению к примесям разная, то такую оценку делать нельзя.

Метод жидкостной хроматографии обеспечивает достоверные данные по содержанию интересующего компонента в смеси. Время выхода компонента из колонки при одних и тех же условиях разделения будет всегда постоянно и может служить характеристикой данного компонента (качественный анализ), а площадь пика - пропорциональна количеству данного компонента в пробе (количественный анализ).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ рН

Водородным показателем (рН) называется отрицательный десятичный логарифм активности ионов водорода.

  рН = - lg а +.

  Н

Измерение рН заключается в сравнении потенциала индикаторного электрода, погруженного в испытуемый раствор, с потенциалом того же электрода в стандартном буферном растворе с известным значением рН.

При калибровке рН-метров пользуются шкалой стандартных буферных растворов.

Таблица 1

┌───┬─────────────────────┬───────────────────────────────────┬────────┐

│ N │  │  рН раствора при температуре  │  │

│п/п│  Наименование  ├─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┤Буферная│

│  │  раствора  │  0  │ 10  │  20 │  25 │ 30  │ 40  │емкость │

│  │  │град.│град.│град.│град.│град.│град.│  │

│  │  │  С  │  С  │  С  │  С  │  С  │  С  │  │

├───┼─────────────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼────────┤

│ 1 │Тетраоксалат  калия,│1,67 │1,67 │1,68 │1,68 │1,69 │1,70 │0,070  │

│  │0,05 моль/л  │  │  │  │  │  │  │  │

│ 2 │Гидротартрат  калия,│  -  │  -  │  -  │3,56 │3,55 │3,54 │0,027  │

│  │насыщенный  при  25│  │  │  │  │  │  │  │

│  │град. С  │  │  │  │  │  │  │  │

│ 3 │Гидрофталат  калия,│4,01 │4,00 │4,00 │4,01 │4,01 │4,03 │0,016  │

│  │0,05 моль/л  │  │  │  │  │  │  │  │

│ 4 │Однозамещенный фосфат│6,98 │6,92 │6,88 │6,86 │6,84 │6,84 │0,029  │

│  │калия + двузамещенный│  │  │  │  │  │  │  │

│  │фосфат  натрия  по│  │  │  │  │  │  │  │

│  │0,025 моль/л  │  │  │  │  │  │  │  │