Общие методы анализа (стр. 31 )

Обработка хроматограмм

По окончании хроматографирования пятна веществ на хроматограммах открывают при просмотре в видимом или ультрафиолетовом свете. При необходимости хроматограмму предварительно обрабатывают (погружением или опрыскиванием) раствором реактива, дающего цветные реакции с хроматографируемыми веществами.

В отдельных случаях пятна обнаруживают путем установления факта угнетения или стимулирования роста бактерий в непосредственной близости от пятна при помещении хроматограммы на инокулированную среду.

Для обнаруженных пятен вычисляют величину Rf по уравнению:

  а

  Rf = ---,

  b

где а - расстояние от линии старта до центра пятна; b - расстояние от линии старта до фронта подвижной фазы.

КонсультантПлюс: примечание.

Приказом Минздрава России от 01.01.2001 N 771 взамен настоящей фармакопейной статьи введена в действие с 1 января 2016 года ОФС.1.2.1.2.0003.15.

ХРОМАТОГРАФИЯ В ТОНКОМ СЛОЕ СОРБЕНТА

Хроматографический процесс, протекающий при движении подвижной фазы в тонком слое сорбента (носителя), нанесенном на инертную поверхность, называется хроматографией в тонком слое сорбента.

Неподвижной фазой в данном случае являются сам твердый сорбент либо вещества, предварительно на него нанесенные. Механизм хроматографического разделения может быть различным, но чаще всего он является адсорбционным. Перемещение подвижной фазы в слое сорбента с целью упрощения аппаратурного оформления процесса хроматографирования, как правило, осуществляется восходящим методом, т. е. под действием капиллярных сил.

По сравнению с хроматографией на бумаге хроматография в тонком слое сорбента имеет ряд преимуществ, основными из которых являются: высокая скорость процесса хроматографирования, возможность использования в качестве неподвижных фаз (носителей) разнообразных сорбентов, а также сильнокислых, щелочных или иных взаимодействующих с бумагой подвижных фаз и жестких методов открытия пятен путем обработки хроматограмм агрессивными веществами при повышенных температурах.

Для хроматографирования могут использоваться готовые пластинки с закрепленным слоем сорбента, выпускаемые промышленностью, и пластинки со специально приготовленным тонким слоем сорбента.

Приготовление пластинок с тонким слоем сорбента

Обычно слой сорбента (чаще всего силикагеля или окиси алюминия квалификации "для хроматографии") с размером частиц 150-200 меш (сито N 61; ГОСТ 4403-67) наносят на стеклянные матовые пластинки подходящего размера. Для закрепления слоя применяют добавки сульфата кальция CaSO4 х 1/2H2O (гипса) или крахмала. Нанесение слоя может осуществляться следующими способами.

Способ 1. Для получения закрепленного слоя сорбента толщиной около 200-300 мкм с площадью 100 кв. см 2 г силикагеля или окиси алюминия (150-200 меш) и 0,1 г гипса растирают с 5 мл воды в фарфоровой ступке до образования однородной жидкой массы, которую немедленно выливают на горизонтально расположенные, тщательно вымытые стеклянные пластинки выбранного размера. Массу разравнивают шпателем и полученный таким образом слой сушат при комнатной температуре, предохраняя от возможных механических и химических загрязнений. Если в частной статье не указано иначе, пластинки активируют в сушильном шкафу при 120 град. С в течение 1 ч. Готовые пластинки с тонким слоем сорбента хранят в эксикаторе над силикагелем или хлоридом кальция.

Примечание. Для получения слоя толщиной около 100-150 мкм нанесение указанного выше количества массы проводят на пластинки с общей площадью 200 кв. см.

Способ 2. Для получения закрепленного слоя сорбента толщиной в несколько десятков микрон 2-3 г гипса растирают в ступке в 40 мл метилового спирта. В суспензию гипса, продолжая растирание, добавляют 40 г силикагеля или окиси алюминия (200-400 меш) и 140 мл хлороформа. Полученную суспензию сорбента из расчета 4,5 мл на 100 кв. см поверхности выливают на тщательно вымытые сухие стеклянные пластинки, расположенные горизонтально. Пластинки, если в частной статье не указано иначе, сушат на воздухе в течение 10-15 мин.

Суспензии сорбентов сохраняют в колбах с притертой пробкой, тщательно взбалтывая перед употреблением.

Способ 3. Для приготовления незакрепленного слоя сорбента последний насыпают на горизонтально расположенное матовое стекло и разравнивают до получения слоя толщиной 1-2 мм валиком из нержавеющей стали диаметром 6-8 мм с цилиндрическими утолщениями на обоих концах. Диаметр утолщения должен превышать на 2-4 мм диаметр валика (соответственно предполагаемой толщине слоя). Длина средней части валика должна быть на 20-30 мм меньше ширины стекла, на которое наносится слой сорбента. Вместо металлического валика можно использовать стеклянную палочку с надетыми на концы кусками резиновой или полиэтиленовой трубки, имеющей подходящую толщину стенки и диаметр.

Методика хроматографического разделения

Для разделения веществ методом хроматографии в тонком слое сорбента используют хроматографические камеры подходящего размера. На дно камеры наливают подвижную фазу в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 0,5 см, камеру закрывают и выдерживают для насыщения парами растворителей 30-60 мин. Стенки камеры для полноты насыщения можно обкладывать фильтровальной бумагой. Анализируемый раствор наносят микропипеткой или микрошприцем на линию старта, проведенную на расстоянии 2-3 см от нижнего края пластинки, так, чтобы пятна образцов отстояли друг от друга и от краев слоя сорбента не менее чем на 2 см. Нежелательное растекание пятен анализируемых проб при нанесении предотвращают путем периодического подсушивания.

После окончательного высыхания нанесенных на линию старта пятен пластинку вносят в камеру. Нижний край пластинки при этом должен погрузиться в подвижную фазу на 0,5-1 см.

Пластинки с закрепленным слоем сорбента располагают под углом 60-90 град., а пластинки с незакрепленным слоем сорбента - под углом 15-20 град. к поверхности жидкости. Когда фронт растворителя пройдет 10-15 см, пластинку вынимают, отмечают положение фронта и открывают пятна хроматографировавшихся веществ, как указано в соответствующей частной статье. Опрыскивание незакрепленного слоя сорбента проводят немедленно после завершения процесса хроматографирования, не допуская высыхания хроматограммы. Результаты хроматографирования оценивают, как описано в разделе "Хроматография на бумаге" настоящей статьи.

СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРИЕМЫ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ

И В ТОНКОМ СЛОЕ СОРБЕНТА

При необходимости достигнуть лучшего разделения анализируемых смесей веществ методами хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента можно применять специальные приемы хроматографирования - повторное и двухмерное.

Повторное хроматографирование заключается в том, что после завершения первого хроматографирования пластинку или бумагу высушивают и подвергают повторному пропусканию той же или иной подвижной фазы в том же направлении.

При двухмерном хроматографировании повторное пропускание той же или иной подвижной фазы осуществляют в направлении, перпендикулярном направлению первоначального движения. Двухмерное хроматографирование целесообразно осуществлять на квадратных пластинках или листах бумаги. Анализируемая проба при этом наносится на диагональ квадрата вблизи одного из его углов.

Двухмерную хроматографию с использованием одной и той же подвижной фазы часто применяют для проверки устойчивости веществ в условиях хроматографирования. Устойчивые вещества образуют пятна, лежащие только на диагонали пластинки или листа бумаги.

КонсультантПлюс: примечание.

Приказом Минздрава России от 01.01.2001 N 768 взамен настоящей фармакопейной статьи введена в действие с 1 января 2016 года ОФС.1.2.1.2.0004.15.

Газовая хроматография

Газовая хроматография - это хроматография, в которой подвижная фаза находится в состоянии газа или пара. В фармацевтическом анализе находит применение как газожидкостная, так и газоадсорбционная хроматография. В газожидкостной хроматографии неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на твердый носитель, в газоадсорбционной хроматографии неподвижной фазой служит твердый адсорбент. В дальнейшем твердый носитель с нанесенной на него жидкой фазой и адсорбент будут обозначаться термином "сорбент". Анализируемые вещества вводятся в поток газа-носителя, испаряются и в парообразном состоянии проходят через колонку с сорбентом, распределяясь в результате многократного повторения актов сорбции и десорбции между газовой и жидкой или газовой и твердой фазами. Отношение количества вещества в неподвижной фазе к количеству вещества в подвижной фазе представляет собой коэффициент распределения, который, в частности, зависит от природы растворенного вещества и количества неподвижной фазы.

Разделенные вещества элюируются из хроматографической колонки потоком газа-носителя, регистрируются детектором и фиксируются на хроматограмме в виде пиков. Полученная хроматограмма служит основой для качественного и количественного анализа смеси веществ. Метод газовой хроматографии применяется для анализа летучих веществ либо веществ, которые могут быть переведены в летучие с помощью специальных приемов и устройств в парообразное состояние.

Газовый хроматограф состоит из систем: измерения и регулирования скорости потока газа - носителя и вспомогательных газов (для детектора); ввода пробы анализируемого образца; газохроматографических колонок, а также систем детектирования, регистрации (и обработки) хроматографической информации; термостатирования и контроля температуры колонок, детектора и системы ввода проб.

Газ - носитель поступает в хроматограф из баллона через редуктор. Обычно в качестве газа - носителя применяют гелий, азот, аргон. При работе с детектором по теплопроводности предпочтительнее гелий, так как он обеспечивает максимальную чувствительность детектора благодаря высокой теплопроводности по сравнению с большинством органических соединений.

Система ввода пробы анализируемого образца обычно состоит из испарителя и мембраны из термостойкой резины, которая прокалывается при вводе пробы. Некоторые хроматографы снабжены также специальными дозаторами для ввода газообразных и твердых веществ. Анализируемые вещества поступают в колонку в парообразном состоянии, поэтому температура испарителя должна обеспечить возможно быстрое испарение компонентов пробы. Жидкие пробы вводят в хроматограф микрошприцем. Объем вводимой пробы зависит от типа детектора, количества неподвижной жидкой фазы и диаметра колонки. Обычно для насадочной аналитической колонки объем пробы жидкости составляет 0,1-1 мкл, а газа - от 0,5 до 5 мл.