Общие методы анализа (стр. 47 )

Для электрофореза пригодны только лучшие сорта хроматографической бумаги, которые должны содержать не менее 96% альфа - целлюлозы. Бумагу предварительно подвергают хроматографической очистке подходящими растворителями. Вместо бумаги могут быть использованы полоски ацетатцеллюлозы.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА МЕЛКОПОРИСТЫХ НОСИТЕЛЯХ

На мелкопористых носителях разделение веществ на зоны идет не только в соответствии с их электрическими зарядами, но и в зависимости от молекулярной массы и формы молекул.

Электрофорез в тонком слое проводится в закрепленном толщиной 1-2 мм слое силикагеля, агара, агарозы, крахмала, полиакриламидного геля, сефадекса, целлюлозы, кизельгура, окиси алюминия, алебастра. Проводящую жидкость вводят в слой носителя или ею опрыскивают слой после его формирования. Раствор исследуемого вещества вносят на поверхность слоя или внутрь отверстий, вырезанных в слое. Электрофоретический процесс можно проводить в устройствах, предназначенных для электрофореза на бумаге.

Электрофорез в крахмальном геле. Гель готовят из гидролизованного крахмала. Горячий гель заливают в кювету глубиной 5-6 мм, которую закрывают специальной крышкой, устроенной так, что в застывшем геле остается поперечный ряд узких щелей (0,3-0,7 мм). В щели вносят кусочки фильтровальной бумаги, смоченной раствором исследуемого вещества, и проводят одномерный или двухмерный электрофорез в горизонтальных или вертикальных установках. Преимущество горизонтального варианта - простота исполнения, вертикального - большая разрешающая сила.

Электрофорез в полиакриламидном геле. Полиакриламидный гель (ПАГ) представляет собой синтетический продукт сополимеризации акриламида и сшивающего агента, чаще всего N, N1-метиленбисакриламида. Благодаря образованию поперечных связей между растущими соседними полиакриламидными цепями, возникающими в результате полимеризации винильных групп, такой гель имеет структуру трехмерной сетки. В отличие от природного полимера крахмала синтетический гель прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей и, наконец, в нем практически отстутствуют адсорбция и электроосмос.

ПАГ готовят на буфере, в котором растворяют акриламид, сшивку и катализатор. Можно получить гель с концентрацией акриламида от 2 до 50%. Повышение концентрации геля понижает его пористость. Буферная система и состав геля определяются природой разделяемого вещества. Концентрацию (с) акриламида подбирают с учетом средней молекулярной массы (М. м.) фракционируемых веществ:

  М. м.  с, %

  3

  < 10 х 10  > 30,0

  3

  10-30 х 10  15,0-30,0

  3

  30-100 х 10  7,5-15,0

  3

  > 100 х 10  < 7,5

Электрофорез выполняют в установках вертикального или горизонтального типа. В ходе электрофореза необходимо следить за тем, чтобы кювета не перегревалась во избежание возникновения конвекционных токов.

Диск - электрофорез представляет собой разновидность электрофореза в ПАГ. Метод имеет высокую разрешающую способность благодаря использованию двух физических явлений:

1) эффекта концентрирования анализируемой смеси в узкой стартовой зоне (бесконечность 10"ми"), который обусловлен автоматическим выравниванием скоростей движения ионов на границе Кольрауша;

2) эффекта молекулярного сита, т. е. разделения вещества по величине молекулярной массы и по форме молекул.

Диск - электрофорез обычно проводят в узких стеклянных трубках, содержащих два разнопористых геля. В ходе электрофореза в верхнем относительно более крупнопористом геле происходит концентрирование смеси, а в нижнем мелкопористом - ее разделение. Верхний и нижний гели готовят на различных буферных растворах, которые в свою очередь отличаются от буфера в электродных сосудах.

Схема проведения опыта: стеклянные трубки последовательно заполняют смесью реактивов, из которых вначале полимеризуется мелкопористый, а затем - крупнопористый гель, после чего трубки соединяют с электродными камерами, которые заполняют буферным раствором так, чтобы в него погрузились верхний и нижний концы трубок. Сверху под буфер в трубки вносят исследуемый образец. После электрофореза гель извлекают из трубок, фиксируют и определяют исследуемые вещества.

Изотахофорез представляет собой также разновидность электрофореза в ПАГ с использованием прерывистой буферной системы, в которой ведущий ион имеет высокую подвижность, а замыкающий - низкую, что обеспечивает высокую разрешающую способность метода.

КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ЗОНАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание электрофореза с реакцией преципитации. Сначала проводят электрофорез белков в тонком слое геля. После электрофореза в геле в направлении движения белков делают боковые углубления, которые заполняют соответствующей антисывороткой. Затем пластинки на 1-2 сут помещают во влажные камеры, где в результате диффузии антигены взаимодействуют с антителами и образуют изогнутые зоны преципитации. Метод позволяет выявлять индивидуальные белки.

Метод пептидных карт представляет собой сочетание бумажной и тонкослойной хроматографии с высоковольтным электрофорезом. В качестве носителей используют силикагель или порошок целлюлозы. Вначале проводят хроматографию, для чего пробу наносят в точку вблизи одной стороны бумаги или пластинки, а затем под углом 90 град. проводят высоковольтный электрофорез. Метод применяют для разделения смеси низкомолекулярных соединений.

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И РЕГИСТРАЦИИ РАЗДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

В зависимости от варианта метода результаты электрофореза оцениваются разными способами:

- документирование (фотографирование или зарисовка);

- определение величины абсолютной или относительной электрофоретической подвижности;

- денситометрия;

- определение характерных химических, физико-химических или биологических показателей фракций.

Для окраски электрофореграмм наиболее часто применяют следующие красители: для белков - амидошварц 10 В, кумаси, бромфеноловый синий, азокармин В; для липидов и липопротеидов - жировой краситель 0, судан черный; для моносахаридов - водородно - анилино - фталатный реактив; для высших жирных кислот - краситель, состоящий из метилового красного и бромтимолового синего.

МЕТОД ФАЗОВОЙ РАСТВОРИМОСТИ

Метод фазовой растворимости - это количественное определение чистоты вещества путем точных измерений величины растворимости.

Практическое выполнение анализа данным методом заключается в определении величины растворимости исследуемого вещества в растворителе в условиях равновесия при постоянных температуре и давлении. Для этой цели прибавляют возрастающие количества образца к постоянному количеству растворителя, помещенному в одинаковые емкости. Системы, состоящие из вещества и растворителя, приводят в состояние равновесия длительным встряхиванием при постоянной температуре. Затем определяют содержание растворенного вещества в каждой системе.

Строят диаграмму (рис. 12) <*>, откладывая по оси ординат массу растворенного вещества на единицу массы растворителя (состав раствора) и по оси абсцисс - массу прибавленного вещества на единицу массы растворителя (состав системы).

--------------------------------

<*> Рис. 12. Типичная диаграмма фазовой растворимости.

АВ - состав системы, соответствующей ненасыщенным истинным растворам; ВС - состав системы, соответствующей насыщенным растворам; СД - линия растворимости; ДЕ - состав системы, насыщенной всеми компонентами испытуемого вещества. (Рисунок не приводится).

При данной температуре в определенном количестве растворителя растворяется определенное количество чистого вещества. Полученный раствор насыщен определенным веществом, но этот же раствор остается ненасыщенным в отношении других веществ, даже если эти вещества могут быть близки по химическому строению и физическим свойствам к данному исследуемому веществу. Равные величины растворимости, полученные в каждой системе, указывают на то, что материал чист или свободен от посторонних веществ. Исключением является случай, когда процентный состав исследуемого вещества равен отношению величин растворимости соответствующих компонентов. Различие в значениях растворимости для каждой системы указывают на наличие примеси или примесей.

Метод фазовой растворимости применим ко всем видам соединений, которые образуют устойчивые истинные растворы.

Растворители. При выборе подходящего растворителя для метода фазовой растворимости пользуются следующими критериями.

1. Растворитель должен иметь такую летучесть, чтобы его можно было выпарить в условиях вакуума - 1 кгс/кв. см, но не настолько летучим, чтобы в процессе анализа происходили его потери. Обычно подходят растворители с точкой кипения от + 60 до + 150 град. С.

2. Растворитель не должен неблагоприятно влиять на образец. Нельзя использовать растворители, которые вызывают разложение образца или реагируют с ним. Следует избегать растворителей, образующих сольваты или соли, так как при высушивании подобных соединений возможно растрескивание кристаллов и как следствие этого - изменение массы высушенных остатков.

3. Степень чистоты и состав растворителя должны быть известны. Допускаются тщательно приготовленные смешанные растворители. Следовые количества примесей в растворителях могут существенно влиять на растворимость.

4. Оптимальной растворимостью испытуемого вещества в избранном растворителе является растворимость в пределах от 5 до 25 мг на 1 г растворителя.

Приборы. Используют термостат, способный поддерживать заданную температуру в пределах +/-0,1 град. С. Для удобства работы обычно выбирают температуру от +25 до +30 град. С. Термостат оборудуют подходящим вибратором, обеспечивающим 100-120 колебаний в секунду и имеющим приспособление с зажимами для ампул. Вместо этого термостат может быть снабжен горизонтальным устройством, способным вращаться со скоростью приблизительно 25 об/мин и имеющим зажимы для ампул.

Емкости, используемые в анализе. Используют любые ампулы вместимостью 15 мл. Можно использовать и другие емкости при условии, что они герметичны и подходят во всех других отношениях (рис. 13) <*>. Выпаривание растворителя проводят в колбочках, пригодных для лиофилизации, или в бюксах подходящей емкости.