Общие методы анализа (стр. 32 )

Газохроматографическая колонка представляет собой прямую, спиральную или U-образную трубку, обычно изготовленную из нержавеющей стали или стекла с внутренним диаметром от 0,6 до 5 мм. Наиболее часто используются колонки длиной 1-3 м.

Эффективность газохроматографической колонки n, характеризующая степень расширения зоны определяемого вещества на выходе газохроматографической колонки, определяется по формуле:

  ┌  l  ┐2

  n = 5,545  │------ │ ,

  │"ми  "│

  └  0,5 ┘

  где l  -  время  удерживания  вещества,  выраженное в единицах

длины  диаграммной  ленты  (например,  мм);  "ми  " - ширина

  0,5

хроматографического пика,  измеренная  на  половине  его  высоты и

выраженная в тех же единицах, что и расстояние удерживания.

Степень газохроматографического разделения веществ R определяют по формуле:

  "ДЕЛЬТА"l

  R = -------------------------,

  "ми  " + "ми  "

  0,5(1)  0,5 (2)

где "ДЕЛЬТА"l - разность расстояний времен удерживания разделяемых веществ 1 и 2.

Температура колонки должна обеспечивать оптимальное разделение компонентов смеси при достаточно коротком времени анализа.

Для анализа смесей с широким диапазоном температур кипения компонентов целесообразно применять газовую хроматографию с программированием температуры либо газовую хроматографию с программированием расхода газа - носителя, либо сочетание этих видов газовой хроматографии.

Твердый носитель служит для удержания тонкой равномерной пленки неподвижной жидкой фазы, его поверхность должна обеспечивать достаточное разделение. Он должен иметь достаточную механическую прочность и быть инертным как по отношению к анализируемым веществам, так и к жидкой фазе. В качестве твердых носителей применяют материалы на основе кремнезема - диатомита или кизельгура (например, сферохромы, хроматоны, хезосорбы, целиты); фторуглеродных полимеров (например, тефлон, полихром); полистирола и сополимеров стирола и дивинилбензола (полисорбы). В отдельных случаях в качестве твердых носителей могут использоваться кристаллы некоторых солей (например, хлорида натрия), стеклянные шарики и графитированная сажа (карбохром). Наиболее часто используемый размер частиц твердого носителя от 0,1 до 0,5 мм. В зависимости от задач анализа свойства носителей можно изменять обработкой их кислотами или щелочами, а также силанизированием.

Неподвижная жидкая фаза представляет собой, как правило, высококипящую жидкость. В качестве жидкой фазы обычно применяют: индивидуальные углеводороды или их смеси, например вазелиновое масло, апиезоны; силоксановые полимеры без функциональных групп; сложные эфиры и полиэфиры; простые эфиры; полифенилы; амиды; силоксановые полимеры с привитыми нитрильными или галогеналкильными группами; одно - и многоатомные спирты; полигликоли; амины; жирные кислоты и т. д.

Перед работой с новой колонкой ее следует кондиционировать при температуре, как правило, на 10-30 град. С превышающей рабочую температуру, в токе газа-носителя в течение нескольких часов. Важно следить за тем, чтобы температура термостата колонки не превышала температурного предела применения данной фазы.

Как правило, неподвижная жидкая фаза наносится на твердый носитель в количестве 1-20% от его массы, наиболее часто используются колонки с содержанием жидкой фазы до 5-10% от массы твердого носителя. Нанесение жидкой фазы на носитель осуществляется из ее раствора в подходящем растворителе. Существует несколько методов нанесения жидкой фазы, из которых предпочтительнее пользоваться наиболее воспроизводимыми методами упаривания раствора при перемешивании в фарфоровой чашке или удаления растворителя в ротационном вакуумном испарителе.

Для обеспечения высокой эффективности разделения применяют капиллярную газовую хроматографию, в которой неподвижная жидкая фаза нанесена в виде тонкой пленки непосредственно на внутреннюю поверхность капилляра. Длина капиллярных колонок обычно составляет от 10 до 100 м, внутренний диаметр - от 0,1 до 0,6 мм.

Автоматическая система измерения, регистрации и обработки хроматографической информации включает в себя детектор, электронные устройства усиления, самопишущий измерительный прибор и интегратор.

Наиболее часто применяют детектор по теплопроводности и пламенно - ионизационный. Действие детектора по теплопроводности основано на изменении теплопроводности газа - носителя в присутствии других веществ. Он характеризуется большой универсальностью, так как чувствителен практически ко всем летучим органическим соединениям. Действие более чувствительного пламенно - ионизационного детектора основано на измерении тока насыщения ионизированной газовой смеси в зависимости от ее состава. Детектор чувствителен к органическим соединениям и нечувствителен к парам воды. Кроме этих двух детекторов, в газохроматографическом анализе лекарственных веществ, особенно если требуется повышенная чувствительность определения, можно использовать селективные детекторы, такие, как термоионный и электронозахватный.

Системы термостатирования и контроля температуры колонок, детектора, узла ввода пробы предназначены для обеспечения необходимых температурных режимов анализа.

Качественный анализ. Наиболее часто используемыми методами качественного анализа, применяемыми для идентификации лекарственных веществ, являются метод веществ - свидетелей и метод относительных удерживаний.

Метод веществ - свидетелей заключается в том, что непосредственно после анализа исследуемого образца в идентичных условиях проводят хроматографирование веществ, присутствие которых в исследуемой пробе вероятно. Совпадение времен удерживания любого из компонентов анализируемой пробы и вещества - свидетеля может служить доказательством идентичности обоих веществ. Можно ввести вещество - свидетель прямо в анализируемый образец. В этом случае критерием идентичности служит увеличение соответствующего пика на хроматограмме. Поскольку соединения различной структуры могут иметь совпадающие времена удерживания (удерживаемые объемы), для большей достоверности проводимой идентификации хроматограммы анализируемого образца и веществ - свидетелей должны быть сняты минимум на двух колонках с неподвижными жидкими фазами, отличающимися по полярности.

Для идентификации веществ по методу относительных удерживаний проводят анализ образца в условиях, указанных в конкретной методике, причем предварительно к пробе прибавляют определенное количество указанного в методике вещества сравнения. Относительное удерживание (ч) определяется по формуле:

  t  - t

  R  0

  ч = ------------,

  t  -  t

  Rср  0

  где t  -  время  газохроматографического  удерживания

  R

анализируемого вещества; t  - время удерживания веществ сравнения;

  Rср

t - время удерживания несорбирующегося вещества.

0

Количественный анализ. Количественный анализ проводят с учетом измерения параметров пиков веществ на хроматограммах. Практически используют два параметра пиков: площадь или высоту. Наиболее часто применяемым параметром является площадь пика.

  Площади пиков  на  хроматограмме определяют одним из следующих

способов:  умножением  высоты  пика  (h) на его ширину  ("ми  "),

  0,5

измеренную на половине его высоты;  планиметрированием;  с помощью

интегратора. В  связи  с  тем что,  чувствительность детекторов по

отношению к разделяемым веществам,  как  правило,  неодинакова,  в

необходимых  случаях  количественному  определению  предшествует

градуировка прибора.

Существует три основных метода количественного анализа: метод абсолютной градуировки, метод внутренней нормализации и метод внутреннего стандарта.

Метод абсолютной градуировки основан на предварительном определении зависимости между количеством введенного вещества и площадью или высотой пика на хроматограммах. В хроматограф вводят известное количество градуировочной смеси и определяют площади или высоты полученных пиков. Строят график зависимости площади или высоты пика от количества введенного вещества. Анализируют исследуемый образец, измеряют площадь или высоту пика определяемого компонента и на основании градуировочного графика рассчитывают его количество.

Метод внутренней нормализации основан на приведении к 100% суммы площадей пиков на хроматограмме.

Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного определяющего параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром вещества для сравнения, введенного в пробу в известном количестве. В исследуемую пробу вводят известное количество такого вещества для сравнения, пик которого достаточно хорошо разделяется с компонентами исследуемой смеси. Проводят анализ пробы с веществом сравнения и рассчитывают количество определяемого вещества.

Последние два метода требуют введения поправочных коэффициентов, характеризующих чувствительность используемых типов детекторов к анализируемым веществам. Для разных типов детекторов и разных веществ коэффициент чувствительности определяется экспериментально.

УСЛОВИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

В методике рекомендуется приводить следующие условия анализа: размеры газохроматографической колонки; тип неподвижной жидкости фазы и ее количество; тип твердого носителя; температуры колонки, испарителя и детектора; газ - носитель и его расход; тип детектора.

В случае необходимости в частных статьях могут быть приведены дополнительные условия проведения хроматографического анализа.

КонсультантПлюс: примечание.

Приказом Минздрава России от 01.01.2001 N 768 взамен настоящей фармакопейной статьи введена в действие с 1 января 2016 года ОФС.1.2.1.2.0005.15.

Высокоэффективная жидкостная хроматография

(жидкостная хроматография высокого давления)

Высокоэффективная жидкостная хроматография (жидкостная хроматография высокого давления) является вариантом колоночной жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза - элюент - проходит через заполняющий колонку сорбент с большей скоростью за счет значительного давления на входе в хроматографическую колонку.