Лабораторная диагностика нарушений гемостаза (стр. 28 )

Рис. 76. Принцип оценки индуцированной агрега­ции. А - до агрегации; Б - агрегация. После добавле­ния индуктора агрегации и формирования агрегатов тромбоцитов происходит просветление суспензии

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

ром (рис. 20) и GPIbα. Стимуляция тромбиново-го рецептора сопровождается активацией тром­боцитов через G-белок, фосфолипазы С и вклю­чение фосфоинозитольного механизма актива­ции. Этот путь сопровождается быстрым увели­чением концентрации цитозольного Са2+ и сек­рецией α-гранул и электронно-плотных 5-гранул. Секретируемый из 5-гранул АДФ существенен для образования агрегатов, а выделяемые α-гра-нулами фибриноген, vWF, тромбоспондин - для их стабилизации. Оккупация молекулами тром­бина высокоаффинных рецепторов GPIbα приво­дит к перестройке фосфолипидной мембраны, стимуляции ее прокоагулянтной активности и повышению аффинности GPIIb-IIIa. В результа­те комплексной стимуляции тромбином практи­чески не наблюдается двухволновой агрегации.

Агрегация с арахидонатом

Арахидоновая кислота в цитратной плазме вызывает дозозависимое изменение формы тром­боцитов, первичную и вторичную агрегацию. Арахидонат активирует тромбоциты без участия специфических рецепторов, проникая внутрь клетки, активируя свои метаболиты - ПГG2,

ПГН2 и тромбоксан. Эту особенность активации тромбоцитов арахидоновой кислотой использу­ют для дифференциации нарушений, связанных с дефицитом пулов хранения и нарушениями в цик-лооксигеназном пути активации тромбоцитов.

Вид агрегатограммы зависит от типа и концен­трации индуктора. Наиболее распространенные индукторы АДФ и адреналин используются в не­скольких концентрациях. Форма агрегатограммы может быть несколько отлична на агрегометрах разных производителей, так как выводимый резуль­тат теста в определенной степени зависит от скоро­сти и характера перемешивания, температуры, спо­соба регистрации и некоторых других факторов.

Лекарственные средства, такие, как аспирин и другие нестероидные противовоспалительные препараты, антибиотики (3-лактамного ряда, не­которые витамины, пряности могут быть причи­ной нарушенной агрегации. Из вышесказанного следует, что для адекватной оценки результатов теста требуется тщательная стандартизованная подготовка больных и стандартизация протоко­ла аналитических процедур.

Болезнь Виллебранда и врожденные наруше­ния функции тромбоцитов легко диагностируют­ся агрегатометрией (табл. 14).

Изменения агрегатограмм при нарушениях функции тромбоцитов

Таблица 14

Н - нормальная агрегатограмма, 4- - сниженная реакция на индуктор агрегации.

Клинический пример 2

6 лет. Обратился за помощью по поводу носового кровотечения. Со слов ро­дителей - единственный ребенок в семье, име­ющий геморрагические проявления в виде кож­ного гемосиндрома, гемартрозов и носовых кровотечений. Ребенок наблюдается по месту

жительства с диагнозом гемофилия А. При но­совых кровотечениях и гемартрозах получает переливания цельной крови с положительным эффектом. При осмотре, помимо кровотечения из полости носа, выявлен кожный гемосиндром смешанного типа - гематомы, экхимозы, пете-хии и пурпурозные элементы. Для оказания эк­стренной помощи был введен концентрат фак-

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

тора VIII, после чего кровотечение останови­лось, однако рецидивировало через несколько часов. С учетом характера кожного гемосинд-рома диагноз гемофилии А вызвал сомнения. Необходимо было проводить дифференциаль­ный диагноз между коагулопатией, болезнью Виллебранда и нарушением тромбоцитарного гемостаза. Было проведено коагулологическое обследование.

Результаты: время кровотечения значитель­но удлинено, количество тромбоцитов 150 х 109/л. ПТ-тест 155%, АЧТВ 31 с (норма 28-43 с), ф. УШ >200%, ф.1Х 195%, ристоцетин-кофакторная ак­тивность 71%. Агрегация тромбоцитов с АДФ, коллагеном и адреналином отсутствует, агрегация тромбоцитов с аггристином нормальная. Данные обследования позволили поставить диагноз: тромбастения Гланцмана.

Исследования агрегации тромбоцитов в образцах цельной крови

Корпорация «Chrono-log» производит агре-гометры, работающие на образцах цельной цит-ратной крови и использующие электронно-им-педансный и люминесцентный методы детек­ции (рис. 77). Прибор регистрирует микротоки, протекающие в специальном электродном бло­ке, при погружении его в различные образцы - цельную кровь, плазму, богатую тромбоцитами (ПБТ), разведенную кровь или во взвесь отмы­тых тромбоцитов. Первоначальный контакт электродов с образцом приводит к образованию монослоя тромбоцитов. Затем при добавлении индукторов агрегации и других активных аген­тов происходит постепенная агрегация тромбо­цитов на электродах, которая приводит к харак­терным изменениям электрических свойств сис­темы.

Методом электронного импеданса можно проводить измерения агрегации в условиях, в

которых оптическая агрегация это сделать не может - в гемолизированных, иктеричных и ли-пемичных образцах. Импедансная агрегометрия может быть использована с успехом при иссле­довании пациентов с синдромом гигантских тромбоцитов, где оптическая агрегометрия при­водит к неправильным результатам.

Исследование агрегации на агрегометрах «Chrono-log» проводится очень быстро: для ис­следования агрегации в 5 мл цельной крови не­обходимо времени меньше, чем требуется для приготовления плазмы для коагулограммы. При этом методика позволяет выявить большинство видов дисфункции тромбоцитов. Высокочув­ствительный импедансный метод позволяет очень быстро и точно провести скрининг для выявления болезни Виллебранда на основе рис-тоцетин-агрегации цельной крови (рис. 78). Этот же подход помогает подтвердить синдром Бер-нара-Сулье у детей, быстро найти объяснение длительным кровотечениям у пациентов, прини­мающих различные противовоспалительные ле­карства.

Рис. 77. Агрегометр «Chrono-log», исследующий агрега­цию тромбоцитов на цельной крови электронно-импеданс-ным методом

Рис. 78. Быстрая диагностика болезни Виллебранда и

врожденных нарушений функции тромбоцитов на агрего-метре «Chrono-log» с цифровым и графическим представ­лением результатов

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Наличие на агрегометре люминесцентного датчика позволяет одновременно с агрегацией тромбоцитов исследовать и другие процессы, на­пример секрецию гранул.

В то же время практически все агрегометры корпорации «Chrono-log», как дополнение к им-педансным и люминесцентным каналам, имеют оптические каналы для проведения классической (турбидиметрической) агрегометрии.

Процессы агрегации в цельной крови наи­более приближены к физиологическим услови­ям in vivo. Именно поэтому достигается высокая достоверность и специфичность результатов ис­следования, что дает возможность не только

быстро провести необходимую диагностику, но и обеспечить надежную программу мониторин­га проводимой терапии в реальном времени. По­скольку импедансная агрегометрия на цельной крови является наиболее адекватным средством для определения гиперагрегации, метод реко­мендуется для исследования пациентов с риском тромбоэмболических осложнений. Этот метод более чувствителен и адекватен по сравнению с оптической агрегацией, поскольку измерения происходят в присутствии всех нативных элемен­тов цельной крови, включая эритроциты и лей­коциты.

Тромбоэластография

Тромбоэластография (ТЭГ) - один из первых методов комплексной оценки гемостаза. Тромбо­эластография была предложена еще в 1948 г. Гар-тертом (Hartert) и до настоящего времени оста­ется единственным методом, который качествен­но и полуколичественно позволяет охарактери­зовать процесс образования сгустка, его механи­ческие характеристики, плотность, стабильность и процесс фибринолиза. В настоящее время ме­тод усовершенствован, он позволяет количествен­но оценить перечисленные параметры. Модифи­кацию метода с использованием компьютерного анализа данных можно назвать тромбоэластомет-рией (ТЭМ). ТЭГ и ТЭМ могут быть использова­ны для исследования цельной крови, цельной кро­ви с антикоагулянтами, богатой и бедной тром­боцитами плазмы с цитратом в качестве антико­агулянта.

Принцип ТЭГ: исследуемый образец помеща­ется между двумя поверхностями, на одну из ко­торых подаются вращательно-колебательные движения, а другая соединена с устройством, при­нимающим и фиксирующим колебания. После добавления в образец активатора свертывания крови начинается образование сгустка. По мере полимеризации фибрина колебания с одной по­верхности начинают передаваться на другую и регистрироваться. Получающаяся кривая зависи­мости амплитуды колебаний от времени харак­теризует процесс свертывания крови, а позже фибринолиза (рис. 79).

Наиболее важной информацией, которую можно извлечь из кривой ТЭГ (рис. 80), является:

•  Время до начала образования фибрина (г-вре-
мя).

•  Время формирования сгустка (к-время).

•  Максимальная амплитуда (зависит от кон­
центрации фибриногена, количества и каче­
ства тромбоцитов, взаимодействия фибрина
и тромбоцитов в сгустке).

•  Время лизиса тромба.

Метод позволяет исследовать как спонтанную коагуляцию, так и индуцированную активатора­ми. Применение различных активаторов и реак­тивов позволяет достичь разных диагностических целей. В качестве дополнительных реактивов мо­гут использоваться гепарин, фибринолитики или их ингибиторы. Изменения ТЭГ, которые отража­ют наиболее распространенные изменения гемос­таза, представлены на рис. 81. Наряду с изменени­ями, вызываемыми лекарственными препаратами, ТЭГ позволяет идентифицировать тромбоцитопа-тии, гиперкоагуляцию и другие нарушения.