Лабораторная диагностика нарушений гемостаза (стр. 30 )

Оптико-механические коагулометры

Коагулометры этого класса характеризуют­ся способностью регистрировать выпадающие хлопья фибрина даже без формирования плотно­го сгустка, что бывает при приеме пациентами ан­тикоагулянтов, а также в случаях коагулопатий. Принцип оптико-механического коагулометра представлен на рис. 84. За счет использования следящей схемы регистрируется изменение пода­ваемого на лампу напряжения, чтобы обеспечи­вался заданный световой поток, проходящий че­рез кювету с образцом. В этом случае резко умень­шается влияние исходной плотности плазмы, ее иктеричности и липемичности, в принципе воз­можно исследовать свертывание плазмы с тром­боцитами.

Турбидиметрические коагулометры

Турбидиметрические коагулометры регис­трируют момент свертывания крови по приро­сту оптической плотности (рис. 85). При свер­тывании плазмы происходит резкое изменение светопропускания или рассеивания. В коагуло-метре программируется, при каком приросте

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Время, с

Рис. 84. Принцип регистрации выпадающего фибрина оптико-механическим коагулометром. Выпавшие в кювете нити фибрина меняют световой поток, падающий на фото­диод. Фотодиод связан через следящую схему компенса­ции с напряжением на лампе. В результате на лампу пода­ется такое напряжение, которое меняет яркость свечения лампы, чтобы световой поток, попадающий на светодиод, поддерживался в заданном диапазоне. По изменению на­пряжения на лампе регистрируется начало выпадения фиб-ринового сгустка

Рис. 85. Принцип регистрации момента образования сгустка турбидиметрическим коагулометром. При свер­тывании плазмы происходит резкое увеличение оптичес­кой плотности в фотометрической ячейке. Коагулометр определяет время от внесения активатора свертывания до момента изменения оптической плотности на ДА (напри­мер, на 0,1 ед. оптической плотности)

оптической плотности по отношению к исход­ному уровню (ΔА) регистрируется момент свер­тывания. Время от внесения в оптическую кю­вету индуктора свертывания до момента дости­жения заданного ΔА определяется как время свертывания плазмы в исследуемом тесте. Тур-бидиметрический принцип используется при определении показателей свертывания плазмы на многофункциональных фотометрах и биохи­мических анализаторах. Фотометрический ка­нал при этом программируется по методу «вре­мя достижения фиксированной величины аб­сорбции». Программы для исследования гемо­стаза стали использовать даже на многофунк­циональных плашечных фотометрах, в которых свертывание плазмы исследуется на стриппах или планшетах.

Основными преимуществами оптических си­стем измерения являются:

1.  Более точные результаты измерений при низ­
ких показателях свертывания. Полностью
исключена проблема «слабого сгустка».

2.  Исключено загрязнение пробы, так как отсут­
ствуют мешалки и другие механические ком­
поненты.

3.  Имеется возможность снижения объема про­
бы, так как не нужно место под механичес­
кие компоненты (мешалки), это важно, осо­
бенно в педиатрии. Кроме того, уменьшает­
ся расход реагентов.

4.  Эргономичность и удобство работы.
Типичным представителем этого семейства

приборов является оптический двухканальный коагулометр KG-1 производства компании «Сог-mау» (рис. 86).

Нефелометрические коагулометры

Нефелометрические коагулометры определя­ют момент образования сгустка по изменению рассеяния света. Новейшие разработки в этой области технологий нашли воплощение в коагу-лометрах фирмы «Sysmex» (Япония), в которых используется принцип определения сгустка по бо­ковому рассеиванию света (рис. 87). Метод рас­сеивания обеспечивает высокое качество анали­зов - высокую специфичность и чувствительность метода детекции сгустка даже для сложной липе-мичной или иктеричной плазмы.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 86. Оптический двухканальный коагулометр KG-1 производства компании «Соrmау». Точность результатов повышается за счет синхронизации времени попадания ре­агента в измерительную кювету и запуска отсчета времени, а также исключения из применения магнитных мешалок в измерительных кюветах, Прибор эргономичен, термостат для проб и реагентов размещен в самом приборе, у кювет есть перемычки и держатели для удобства переноса из термо­стата в измерительные ячейки. Работа на приборе эконом­на, так как снижен расход реагентов за счет уменьшения объема кювет, использования многоразовых кювет

Рис. 87. Нефелометрический принцип измерения све­торассеяния, заложенный в основу определения момен­та выпадения сгустка на коагулометрах фирмы «Sysmex» (Япония). Метод позволяет повысить точность измерений и их воспроизводимость до 2-3%, а также снизить влияние на результат самого образца. Анализаторы работают на любых реагентах (в том числе на российских)

В табл. 15 указаны преимущества и недостат­ки автоматизированных коагулометров, исполь­зующих разные принципы регистрации выпада­ющего сгустка.

Современные коагулометры сочетают в од­ном приборе несколько методов измерения, по-

этому могут использоваться для комплексной оценки гемостаза. Так, фирма «Sysmex» предла­гает серию коагулометров с разными возможно­стями и производительностью для любой клини­ко-диагностической лаборатории любого уровня исследования гемостаза (рис. 88).

Таблица 15

Преимущества и недостатки различных методов обнаружения сгустка

Методы	Преимущества	Недостатки
Механический	Принципиальная возможность работы на цельной крови, высокая толерантность к типу используемых реагентов и пробирок, низкая стоимость анализаторов	Низкая чувствительность - нет детекции слабых сгустков, необходимо применять мешалки в пробах
Оптико-механический	Точность больше, чем в механическом мето­де, перемешивание пробы во время снятия показаний	Чувствительность ниже нефело-метрического метода, необходимо приме­нять мешалки в пробах
Турбидиметриче-ский	Чувствительность выше предыдущих мето­дов, низкая стоимость анализаторов	Чувствительность ниже нефело-метрического метода
Нефело­метрический	Высокая чувствительность, высокая точность измерения	Высокая стоимость прибора

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 88. Коагулометры фирмы «Sysmex»

Амидолитические методы с использованием хромогенных и флуорогенных субстратов

Применение синтетических хромогенных суб­стратов явилось прорывом при исследовании от­дельных ферментов или ингибиторов, которые не учитываются простыми коагуляционными теста­ми или очень трудны для стандартизации. Во мно­гих случаях хромогенные субстраты являются спе­цифичными и позволяют определить протеолити-ческую активность отдельных компонентов плаз­менного гемостаза и их ингибиторов. Эти тесты схожи с тестами клинической химии, поэтому лег­ко автоматизируются и могут выполняться на био­химических анализаторах как в клинико-диагнос­тических, так и в научных лабораториях.

Принцип тестов с хромогенными субстрата­ми представлен на рис. 89. Протеаза расщепляет короткоцепочечный пептид (из 3-10 аминокис­лот), к которому через эфирную связь пришит хромоген (в нашем случае паранитроанилин - pNA). Комплекс пептид-pNA имеет максимум поглощения в области короткого ультрафиоле­та, свободный pNA - при 380 нм. Итоговая кон­центрация pNA пропорциональна активности протеазы и определяется по увеличению погло­щения светового пучка с длиной волны 405 нм.

Рис. 89. Принцип определения активности протеолити-ческого фермента (протеазы) с использованием хро-могенного субстрата. Максимум поглощения паранитро-анилина, связанного с пептидом, находится в области ко­роткого ультрафиолета, а свободного паранитроанилина -380 нм, При длине волны 405 нм поглощает практически толь­ко свободная форма хромогена, на этой длине волны про­водится регистрация протеолитической реакции

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Для оценки активности факторов гемостаза стали использовать флуорогенные субстраты, в

частности 7-амино-4-метилкумарин (АМК), кото­рый имеет максимум эмиссии при 440 нм. Флуо­рогенные субстраты обладают большей аналити­ческой чувствительностью и позволяют измерить специфическую активность компонентов гемо­стаза в большем диапазоне, чем хромогенные суб­страты. Они могут использоваться для определе­ния компонентов гемостаза, присутствующих в плазме в следовых концентрациях или обладаю­щих относительно низкой активностью.