Лабораторная диагностика нарушений гемостаза (стр. 40 )

Определение протеина S иммунохимическим методом

Иммунохимический метод достаточно широ­ко распространен. Первая генерация тест-набо­ров определяла «общий протеин S», включая сво­бодную форму и форму протеина S, связанную с белком С4-СП. Наборы последних генераций позволяют определять «свободный протеин S» прямо без предварительной обработки. Чаще все­го используют турбидиметрический метод с по­листироловыми частицами или метод ELISA. Недостатком иммунохимического метода являет­ся то, что он выявляет протеолитически неактив­ные формы протеина S, которые иногда появля­ются в плазме.

Оценка результатов

Уменьшение содержания (активности) проте­ина S наблюдается при:

•  врожденном (наследственном) дефиците;

•  врожденном (наследственном) уменьшении
свободной фракции протеина S;

•  заболеваниях печени с нарушением синтети­
ческой функции;

•  нефротическом синдроме;

•  ДВС-синдроме;

Рис. 117. Принцип определения протеина S коагуляционным методом

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

•  системной красной волчанке;

•  лечении L-аспарагиназой;

•  лечении пероральными (непрямыми) антико­
агулянтами;

•  приеме эстрогенов (пероральных контрацеп­
тивов);

•  беременности, в послеродовом периоде;

• наличии аутоантител к протеину S.
Относительный дефицит протеина S наблю­
дается при повышении С4-СП. С4-СП - белок
острой фазы, его количество повышается в
плазме крови при воспалении, аутоиммунных
реакциях, беременности, у женщин, принима­
ющих стероидные контрацептивы. С4-СП оп­
ределяют методом иммунотурбидиметрии или
ELISA.

Определение антитромбина

В клинико-диагностических лабораториях AT определяют иммунохимическими методами (ELISA, турбидиметрия, нефелометрия), тестами с хромогенными субстратами или коагуляцион-ными методами.

Методом с хромогенным субстратом AT оп­ределяется через фактор Ха или Па при насы­щающей концентрации гепарина. Принцип оп­ределения AT представлен на рис. 118. При вы­боре предпочтение отдают методу с использо­ванием ф. Ха, так как он более стабилен и под­вержен меньшим влияниям со стороны интер­ферирующих воздействий, чем тромбин (фак­тор На).

Нормальный уровень активности AT в плаз­ме взрослых колеблется в диапазоне 75-125%, этот диапазон практически одинаков при исполь­зовании разных тест-наборов. Дефицит AT - се­рьезный фактор риска развития венозных тром­бозов.

У новорожденных уровень AT составляет около 50% и достигает уровня взрослых к 6 мес.

Небольшое снижение AT наблюдается в середи­не менструального цикла, в пред - и послеродо­вом периоде, при токсикозах второй половины беременности, в послеоперационном периоде. Эти сдвиги более выражены у пациентов с груп­пой крови А (II), а также у пожилых.

Снижение содержания (активности) А Т от­мечается при:

•  врожденном (наследственном) дефиците или
аномалии AT (снижение активности или чув­
ствительности к гепарину);

•  заболеваниях печени (опухоли, цирроз, алко­
гольный гепатит);

•  нефротическом синдроме (протеинурия свы­
ше 5 г/л);

•  карциноме легких;

•  ДВС-синдроме;

•  множественных травмах, тяжелых родах, по­
здних гестозах;

•  приеме эстрогенов (пероральных контрацеп­
тивов), кортикостероидов;

•  лечении L-аспарагиназой;

•  многие протеазы, включая гранулоцитарную
эластазу, могут вызывать деградацию AT.
Тест может применяться для мониторинга

лечения гепарином. Длительная гепаринотера-пия может приводить к снижению активности AT в плазме. Лечение высокими дозами гепари­на, особенно нефракционированным гепарином, приводит к транзиторному снижению AT по ме­ханизму потребления (рис. 119), особенно у боль­ных с тяжелой патологией, в критических слу­чаях, при ДВС-синдроме, сепсисе, злокачествен­ных опухолях.

Увеличение содержания (активности) А Т от­мечается во время менструации, а также при:

•  остром вирусном гепатите;

•  холестазе;

•  приеме анаболических стероидов;

•  лечении пероральными (непрямыми) антико­
агулянтами.

Рис. 118. Принцип определения антитромбина (AT) хромогенным методом

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 119. Снижение уровня AT в плазме в период активно­го лечения нефракционированным гепарином

Лабораторная диагностика антифосфолипидного синдрома и волчаночного антикоагулянта (см. также «Тромбозы. Волчаночныи антикоагулянт»)

При антифосфолипидном синдроме в крови циркулируют антитела против фосфолипидов или фосфолипид-связанных белков. При этом синдро­ме возникает лабораторный феномен, при кото­ром происходит удлинение времени свертывания крови в тестах, выполняемых на фосфолипидах (АЧТВ, ПВ). Этот феномен впервые был описан у пациентов с системной красной волчанкой и по­этому получил название волчаночного антикоагу­лянта. Клинически, однако, при антифосфолипид­ном синдроме и волчаночном антикоагулянте нет геморрагических проявлений, но есть выраженная тенденция к патологически усиленному тромбооб-разованию. Нельзя ставить знак равенства между

волчаночным антикоагулянтом и антифосфоли-пидным синдромом. В некоторых случаях при ко-агулологических признаках волчаночного антико­агулянта не находят иммунологических признаков антифосфолипидного синдрома, в свою очередь антифосфолипидный синдром не всегда сопровож­дается коагулологическими признаками волчаноч­ного антикоагулянта.

Антифосфолипидный синдром, сопровождаю­щийся волчаночным антикоагулянтом, выявляют комбинацией фосфолипид-зависимых коагуляци-онных и иммунохимических методов, причем на­дежная диагностика обеспечивается только комп­лексным использованием группы тестов. Как пра­вило, волчаночныи антикоагулянт распознается по удлинению фосфолипид-зависимых коагуляцион-ных тестов. Волчаночныи антикоагулянт являет­ся неспецифическим ингибитором. При подозре­нии на волчаночныи антикоагулянт необходимо начинать лабораторные анализы со екрининговых тестов и теста смешивания. В табл. 29 представле­ны данные екрининговых тестов при врожденном дефиците факторов VIII и IX, при наличии специ­фического ингибитора и волчаночном антикоагу­лянте. Важно помнить, что не все реактивы для проведения АЧТВ одинаково чувствительны к волчаночному антикоагулянту. Для анализа АЧТВ при подозрении на волчаночныи антикоагулянт необходимо применять реактивы, содержащие ка­олин, но не эллаговую кислоту.

Выявление волчаночных антикоагулянтов проводят последовательно: сначала в екринин­говых методах, а затем в подтверждающих. На рис. 120 представлен алгоритм выявления вол-

Таблица 29

Изменения екрининговых тестов при врожденном дефиците факторов VIII и IX, наличии специфического ингибитора и волчаночном антикоагулянте

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 120. Алгоритм выявления волчаночных антикоагулянтов

чаночного антикоагулянта (, Мо-мот А. П., 1999).

Еще одним подтверждающим тестом для опре­деления волчаночного антикоагулянта является тест разведения. В серии последовательных разведений анализируемой плазмы буфером активность фак­торов свертывания крови, определяемая коагуля-ционным методом, относительно возрастает при наличии волчаночного антикоагулянта (табл. 30).

Таблица 30

Эффект разведения на активность факторов

свертывания в присутствии волчаночного

антикоагулянта

Для подтверждения диагноза волчаночного ан­тикоагулянта необходимо провести подтверждаю-

щие тесты, например тест нейтрализации на тром­боцитах. Проводится определение АЧТВ и активно­сти факторов внутреннего пути плазмы больного до и после инкубации с тромбоцитами здорового до­нора или эритрофосфатидом. При наличии волча­ночного антикоагулянта АЧТВ сокращается, а ак­тивность факторов возрастает за счет связывания части антифосфолипидных антител на тромбоцитах здорового человека. В группу подтверждающих вне­сены также индексы, основанные на сравнении ре­зультатов фосфолипид-зависимьгх и фосфолипид-не-зависимых тестов (лебетокс/эхитоксовый индекс).

Для уточнения диагноза антифосфолипидно-го синдрома необходимо провести определение кардиолипиновых антител с использованием ме­тода ELISA. В табл. 31 представлен перечень ан­тифосфолипидных антител, которые выявляют­ся ИФА и коагуляционным методом.

Определение антифосфолипидных антител (АФА)

АФА, выявляемые твердофазным ИФА, пред­ставляют собой различные комбинации иммуно-

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Таблица 31

Спектр антифосфолипидных антител, присутствующих в сыворотке больных А ФС

глобулинов, принадлежащих к классам IgG и IgM, реже IgA. Определяют аутоантитела против кардиолипина, фосфатидилсерина, β2-гликопро-теина I. Специфичность диагностики по антите­лам различна: антитела против β2-гликопротеи-на I демонстрируют большую специфичность, чем антитела к кардиолипину или другим фосфоли-пидам. Лабораторный диагноз антифосфолипид-ного синдрома можно ставить только в том слу­чае, если содержание диагностических аутоанти-тел в сыворотке крови, выявленных иммунофер-ментным методом, подтверждает патологию по­вторно с интервалом, по крайней мере, в 6 недель.