Лабораторная диагностика нарушений гемостаза (стр. 36 )

Удлинение АЧТВ и/или ПВ может быть выз­вано дефицитом факторов свертывания или при­сутствием ингибиторов, в частности аутоантител, волчаночного антикоагулянта и др. Для диффе­ренцирования дефицита факторов свертывания от присутствия специфического ингибитора или волчаночного антикоагулянта необходимо про­вести скрининговое исследование (количество тромбоцитов, АЧТВ, ПТ), исследование коррек­ции активности факторов или скрининговых тес­тов при смешивании тестируемой плазмы с нор­мальной, контрольной плазмой и тест разведения. Особенности проведения скрининговых тестов были описаны выше.

Исследование коррекции активности факторов свертывания проводится путем смешивания иссле-

дуемой плазмы с контрольной нормальной плаз­мой. Соотношения компонентов могут быть различными. Чаще применяется смешивание 1:1 (1 часть исследуемой плазмы / 1 часть контроль­ной), это соотношение удобно для подсчета и обла­дает неплохой чувствительностью. При низкой ак­тивности ингибитора можно использовать соотно­шение: 2 части исследуемой плазмы / 1 часть конт­рольной. При высокой активности можно исполь­зовать соотношение 1:4 и более и по степени коррек­ции косвенно судить об активности ингибитора.

После смешивания необходимо проводить те­сты немедленно и через 1 час инкубации, что по­зволяет определить характер ингибитора (табл. 24).

Для более точной дифференциальной диагно­стики между истинным и вторичным дефицитом

Дифференциальная диагностика врожденного дефицита факторов VIII и IX, специфического ингибитора и волчаночного антикоагулянта

Таблица 24

можно провести пробу с разведением, по край­ней мере, до 3 разных концентраций. Пробы с дефицитом показывают при разведении одинако­вый расчетный процент фактора в цельной плаз­ме. Пробы, в которых присутствует ингибитор, при разведении показывают относительное уве­личение фактора, что связано с диссоциацией

Рис. 102. Метод разведения пробы позволяет разли­чить истинный дефицит фактора и его ингибирование.

При истинном дефиците разведение не меняет относитель­ной активности фактора, а при подавлении активности фактора ингибитором разведение сопровождается отно­сительным повышением активности фактора

комплекса фактор-ингибитор и освобождением фактора из блокированного состояния (рис. 102).

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Определение фибриногена

Определение фибриногена - один из рутин­ных тестов коагулограммы, выполняемый разны­ми методами.

Определение по Клауссу

Определение фибриногена по Клауссу счита­ется наиболее адекватным тестом, выполняется на коагулометрах. Он основан на определении времени выпадения сгустка при добавлении очень высокой концентрации тромбина к разбавленной в 10-20 раз плазме. При этом логарифм времени выпадения сгустка прямо пропорционален лога­рифму концентрации фибриногена. В этих усло­виях критической для свертывания становится концентрация фибриногена. Калибровочная кри­вая показывает укорочение времени свертывания при увеличении концентрации фибриногена. Если время свертывания очень короткое (<5 с), то тест проводится на разведенной плазме. Гепарин не оказывает влияния на результаты определения фибриногена. Основными ограничениями мето­да определения фибриногена по Клауссу являет­ся чувствительность результатов к гипо-, дис - и гиперфибриногенемии, а также к ПДФ, которые влияют на процесс полимеризации фибрин-моно­меров и могут быть причиной ложно низких ре­зультатов (рис. 103).

Турбидиметрический метод

Определение фибриногена по изменению мутности плазмы с использованием батроксоби-

Рис. 103. На результаты определения фибриногена по методу Клаусса могут оказывать влияние присутствую­щие в системе циркуляции продукты деградации фибри­ногена/фибрина (ПДФ), а также гипо-, дис - и гиперфиб-риногенемия

на широко используется на автоматических ко-агулометрах и клинических анализаторах. В руч­ном исполнении он малопригоден, так как из­менение мутности нелинейное, необходимо ки­нетическое измерение пропускания. В частности, фирмой «Instrumentation Laboratory» (IL) разра­ботан кинетический метод определения фибри­ногена на основе использования коммерческого тромбопластина и неразведенной плазмы (PT-Fib-rinogen Recombinant). Определено, что в турбиди-метрическом тесте «протромбиновое время (ПВ)» скорость нарастания мутности (производная из­мерения мутности) при выпадении фибрина про­порциональна концентрации фибриногена в плазме. Фактически ставится турбидиметричес-кий метод определения ПВ, и в этом же тесте оп­ределяется концентрация фибриногена. Однако для этого необходимо, чтобы прибор, регистри­рующий изменение пропускания, имел возмож­ность автоматически определять производную

В этом исполне-

изменения пропускания

нии результаты менее подвержены влиянию ПДФ и дисфибриногенемиям.

Иммунохимические методы

Иммунохимические методы для фибриноге­на основаны на турбидиметрическом или нефе-лометрическом способах регистрации, исполь­зовании поликлональных антител и адаптиро­ваны на иммунохимические анализаторы. Как правило, для каждого иммунохимического ана­лизатора применяется специфический тест-на­бор на фибриноген. Недостатком иммунохими-ческих методов является то, что они не диффе­ренцируют нативный фибриноген и продукты его деградации. Это особенно существенно при ведении больных на тромболитической тера­пии, обширных тромбозах и ДВС-синдроме, когда происходит значительное увеличение в плазме ПДФ.

ELISA-метод основан на применении специ­фических моноклональных антител. Однако этот метод очень дорог и пока не нашел широкого применения в лабораторной практике для опре­деления фибриногена.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Интерпретация результатов

Референтный диапазон для фибриногена в плазме в норме составляет 1,8-3,5 г/л (часто при­водят значения 2-4 г/л), практически не зависит от возраста и пола. Печень синтезирует 2-5 г фиб­риногена в день, время полувыведения фибрино­гена из крови составляет около 4 дней.

Фибриноген - острофазный белок. Концент­рация его может превышать 10 г/л при тяжелых бактериальных инфекциях, при травме и тром­бозе. Повышение уровня фибриногена в острой фазе воспаления, как правило, имеет транзитор-ный характер. У курящих людей уровень фиб­риногена в плазме крови несколько выше, чем у некурящих. К значительному росту фибрино­гена приводят заболевания почек (пиелонеф­рит, гломерулонефрит, гемолитико-уремичес-кий синдром), коллагенозы (ревматоидный ар­трит, узелковый периартериит), ночная паро-ксизмальная гемоглобинурия, новообразования (рак легкого).

При атеросклерозе наблюдается устойчивое увеличение фибриногена, трудно корригируемое лекарственными препаратами. В результате риск сердечно-сосудистых заболеваний повышается с возрастанием исходного уровня фибриногена в интервале 3,0-4,5 г/л. Обнаружено, что повыше­ние уровня фибриногена в плазме крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями предше-

ствует развитию инфаркта миокарда и инсульта. Корреляция между уровнем фибриногена и раз­витием этих осложнений особенно четко просле­живается у пациентов молодого и среднего возра­ста. Определение уровня фибриногена - наиболее чувствительный тест для выявления бессимп­томных стадий заболевания периферических ар­териальных сосудов.

Дисфибриногенемия - относительно часто встречающееся заболевание, причем это состоя­ние может определяться несколькими мутациями, одни из которых не сопровождаются, другие со­пряжены с кровотечениями, а при некоторых -развиваются тромбозы.

Снижение концентрации фибриногена в плазме наблюдается при врожденном дефици­те фибриногена, печеночно-клеточной недоста­точности, ДВС-синдроме, острых фибриноли-тических состояниях, поражениях костного мозга (лейкоз, опухолевые метастазы), при ин­фекционном мононуклеозе. Гипофибриногене-мию могут вызвать такие лекарственные пре­параты, как вальпроат натрия, фибраты, фено­барбитал, стрептокиназа, урокиназа, L-acnapa-гиназа. Физическая перегрузка снижает фибри­ноген. Лекарственную дефибринизацию плаз­мы можно достичь, используя ферменты змеи­ного яда (Reptilase® или анкрод), которые при­меняются для улучшения реологии крови за счет снижения вязкости.

Определение фактора Виллебранда (vWF)

Определение vWF проводится в основном для:

•  диагностики и последующего мониторинга
врожденной или приобретенной болезни Вил­
лебранда;

•  диагностики тромбофилии;

•  дифференциальной диагностики гемофилии А.
Имеется несколько методических подходов

для диагностики болезни Виллебранда. Один из алгоритмов диагностики болезни Виллебранда представлен в табл. 25.

Концентрация vWF определяется методами иммунотурбидиметрии, ELISA, «ракетным» элек­трофорезом. Связывающая способность фактора Виллебранда с коллагеном определяется в мик-

роплашках, покрытых коллагеном, методом ELISA. Результат выражается как % от нормы. Состав субъединиц определяется электрофорезом в геле агарозы или иммуноблотом. Функциональ­ная активность определяется методом агглюти­нации фиксированных или отмытых тромбоци­тов или агрегации в богатой тромбоцитами плаз­ме при индукции ристомицином (Ристоцетин®). Метод с хромогенными субстратами в настоящее время рекомендуется использовать только как ориентировочный.