Лабораторная диагностика нарушений гемостаза (стр. 39 )

Тест для диагностики фактора V Лейден

Мутация гена фактора V (фактор Лейден) оценивается как наиболее распространенная при­чина РАПС. Эту патологию можно выявить при проведении теста на РАПС с плазмой пациента, разбавленной 1:5 плазмой с дефицитом ф. V. Этот тест обладает высокой специфичностью и чув­ствительностью на выявление фактора V Лейден (табл. 28).

Тест на РАПС проводится также с использова­нием змеиного яда, обозначаемого как протак (Рго-tac), специфически активирующего протеин С. При внесении активатора протеина С в смесь нор-

Примеры резистентности к активированному протеину С

Таблица 27

Таблица 28

Примеры определения резистентности к активированному протеину С методом без разведения и методом разведения испытуемой плазмы плазмой с дефицитом ф. V

 

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

мальной и дефицитной по ф. V плазмы время свер­тывания в тесте АЧТВ удлиняется примерно в 2 раза. Если имеется РАПС, удлинение АЧТВ вы­ражено в малой степени.

Определение протеина С

Для определения протеина С разработано несколько методов: иммунохимический метод, метод с хромогенным субстратом и коагуляцион-ный вариант. Для функциональных методов ис­пользуется специфический активатор протеина С из яда змеи щитомордника, обозначаемый как протак.

Определение протеина С с использованием хро-могенного субстрата

Рис. 113. Принцип определения протеина С с использо­ванием хромогенного субстрата, АПС - активированный протеин С

Определение основано на активации протеи­на С активатором протак с последующим опре­делением (кинетическим методом или методом конечной точки) изменения оптической плотнос­ти пробы из-за образования паранитроанилина (рис. 113). Этот метод прост, специфичен, легко автоматизируется. Так как протеин С - витамин-К-зависимый гликопротеин, то при лечении не­прямыми антикоагулянтами (антагонистами ви­тамина К) появляются PIVKA-формы протеина С, которые не обладают антикоагулянтной актив­ностью, но определяются методами с хромоген-ными субстратами. Поэтому у больных, прини­мающих непрямые антикоагулянты, могут быть завышенными результаты определения протеина С хромогенными методами.

разцах исследуемой плазмы активируется про-таком. Для контроля тест проводится с и без протака (рис. 114). Активированный протеин С вызывает протеолиз и соответственно инактива­цию факторов Va и VIIIa в плазме (рис. 115). Последнее сопровождается удлинением времени свертывания в тесте АЧТВ, по которому оцени­вается активность протеина С в плазме пациен­та. Если фактор Va нечувствителен к активному протеину С, то АЧТВ не удлиняется в присут­ствии активатора протеина С. Рассчитывают отношение АЧТВ с протаком/АЧТВ без прота­ка, величина которого определяется в конкрет­ной лаборатории, так как тест зависит от исполь­зованных приборов и реактивов. Тем не менее этот коэффициент близок к 1 практически у всех больных с фактором Лейден и с дефицитом про­теина С и существенно выше 1 в случаях без де­фицита активности протеина С и при дисфунк­ции протеина S. Метод легко автоматизируется.

Коагуляционный метод оценивает актив­ность протеина С, фиксирующегося карбоксили-рованной частью на фосфолипидах. PIVKA-фор­мы не функционируют в этой системе, и тест не дает ложных результатов у пациентов, принима­ющих непрямые антикоагулянты или имеющих дефицит витамина К.

Исказить результаты теста могут такие фак­торы, как наличие мутации ф. V Лейден, присут­ствие в плазме волчаночного антикоагулянта,

Определение протеина С коагуляционным ме­тодом

Пробы пациентов сопоставляются с дефи­цитной по протеину С плазмой, которую полу­чают методом иммуносорбции. Протеин С в об-

Рис. 114. Принцип скрининга на резистентность к акти­вированному протеину С (РАПС). Активатор протеина С из змеиного яда (протак), добавленный к пробе, в норме существенно удлиняет АЧТВ, Если же имеет место РАПС, то удлинения АЧТВ в присутствии протака не происходит

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

 

Рис. 115.Принцип определения протеина С коагуляционным методом. АПС - активированный протеин С, ФЛ фосфолипиды

терапия гепарином. Для получения достоверных результатов очень важно качество используемой протеин-С-дефицитной плазмы.

У некоторых пациентов, принимающих не­прямые антикоагулянты, выявляются чрезвычай­но низкие цифры содержания протеина С. Эти результаты могут быть связаны не только с ис­тинным дефицитом протеина С, но и с развитием резистентности фактора Va к АПС.

Определение протеина С иммунохимическим методом

Иммунохимическое определение протеина С применяется реже, чем функциональные методы. Это объясняется тем, что данный способ выявля­ет только классическое снижение концентрации протеина С и не определяет его функциональную неполноценность. Методическим обеспечением этого определения чаще всего служат автомати­зированный турбидиметрический метод или ELISA-тест.

Оценка результатов

В норме активность протеина С у взрослых составляет 70-140%.

Небольшое повышение протеина С отмеча­ется во время беременности, а уменьшение - в пос­леродовом и послеоперационном периодах.

Снижение содержания (активности) протеи­на С наблюдается при:

•  врожденном (наследственном) дефиците или
аномалиях протеина С;

•  геморрагической болезни новорожденных;

•  заболеваниях печени с нарушением функции;

•  синдроме острой дыхательной недостаточно­
сти;

•  менингококковом сепсисе;

•  ДВС-синдроме;

•  гемодиализе;

•  лечении L-аспарагиназой;

•  лечении пероральными (непрямыми) антико­
агулянтами (дефицит витамина К).
Отдельные результаты могут колебаться в

зависимости от используемых методов и тест-на­боров, тем более что многие из них разработаны до того, как стала известна мутация гена факто­ра V Лейден. В общем случае разведение пробы может минимизировать влияние фактора V Лей­ден в коагуляционных тестах.

В некоторых случаях при лечении больных с дефицитом протеина С непрямыми антикоагулян­тами у них могут возникнуть некрозы кожи в ре­зультате рикошетных тромбозов. Если антикоагу­лянты назначаются в высокой дозе без поддержки гепарином, то возникает состояние, при котором протеин С очень быстро снижается (время его по­лужизни в системе циркуляции 4-6 ч). В то же вре­мя витамин-К-зависимые факторы свертывания, в том числе протромбин, остаются еще в пределах нормы (у них период полужизни 16-20 ч) (рис. 116).

Рис. 116. Быстрое снижение протеина С, превышающее уменьшение витамин-К-зависимых факторов свертывания, может быть причиной возникновения тромботического со­стояния (рикошетные тромбозы) при начале лечения высо­кими дозами непрямых антикоагулянтов

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Эта ситуация может усугубляться тем, что непря­мые антикоагулянты начинают назначать в слу­чае развития тромбозов или угрожающей ситуа­ции по тромбообразованию (при воспалении, ин­фекциях, лихорадке), когда система прокоагулян-тов активирована. Быстрое снижение протеина С провоцирует в этом случае массивное тромбооб-разование, проявляющееся вплоть до некрозов кожи. Непосредственно в период лечения непря­мыми антикоагулянтами (кумаринами) определе­ние протеина С затруднено. Определять его сле­дует до начала лечения кумаринами.

Определение протеина S

Протеин S - витамин-К-зависимый белок, который является кофактором АПС. Эта функ­ция положена в основу всех известных коммер­ческих тест-систем определения протеина S. Опи­саны случаи как функционального, так и количе­ственного дефицита протеина S. При проведении тестов важно помнить, что протеин S присутству­ет в плазме частично в свободном состоянии, ча­стично в комплексе с С4-связывающим протеи­ном (С4-СП), но активна только свободная фор­ма протеина S.

Определение протеина S коагуляционным ме­тодом

Для определения протеина S необходимо использовать тест-систему, содержащую очищен­ный активный протеин С, его субстрат - фактор Va и дефицитную по протеину S плазму. После ин­кубации исследуемой плазмы с тест-системой определяют время свертывания, выполняя тест АЧТВ или индуцируя активацию змеиным ядом, фосфолипидами и Са2+ (рис. 117). Удлинение вре­мени свертывания пропорционально активности протеина S. Специфичность метода относитель­ная, так как фактор V Лейден, высокий уровень

ф. VIII и волчаночный антикоагулянт могут су­щественно влиять на результаты теста, а именно: с этими факторами часто проводят дифференци­альную диагностику, определяя протеин S. На результаты влияют качество дефицитной плазмы и препаратов АПС, а также состав фосфолипи-дов, поэтому значения теста зависят от конкрет­ного производителя. Так как коагуляционный метод подвержен действию многих интерфериру­ющих факторов и не стандартизован, то предпо­читают использовать иммунохимический метод для определения протеина S.