Лабораторная диагностика нарушений гемостаза (стр. 37 )

Алгоритмы дифференциальной диагностики приводятся в разделе, посвященном болезни Вил­лебранда.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Таблица 25

Алгоритм диагностики болезни Виллебранда

 

Определение с использованием хромогенного субстрата

Определение фактора X с использованием хромогенного субстрата

Определение фактора X - один из самых распространенных методов с использованием хромогенных субстратов. Это объясняется тем, что по активности фактора Ха в последнее вре­мя все больше и больше контролируют анти-коагулянтный эффект низкомолекулярных ге-паринов (табл. 20). Появились предложения контролировать лечение непрямыми антикоа­гулянтами также с помощью определения фак­тора Ха.

В тесте используют фермент яда гадюки Рас­села, активирующий фактор X (RVV-X - factor X activation enzyme from Russel viper venom), или яда гюрзы обыкновенной - лебетоксовый тест. Ак-

тивный фактор Ха определяют в прямой реакции с хромогенным субстратом, в частности с Pefa-chrome® FXa (фирма «DADE Behring Marburg GmbH», Германия). Принцип метода представ­лен на рис. 104.

Рис. 104. Принцип определения содержания фактора X

с использованием хромогенного субстрата. pNA-пара-нитроанилин. Измерение проводится при длине волны (λ) 405 нм фотометрическим методом

Определение фактора VIII с использованием хромогенного субстрата

Определение фактора VIII основано на том, что количество образующегося фактора Ха в ре­акциях активации плазменного гемостаза про­порционально содержанию фактора VIII в пробе (рис. 105).

Этот тест выполняет не только аналитичес­кую функцию, но и характеризует функциональ­ную активность, так как фактор VIIIa оценива­ется в присутствии физиологических кофакторов фосфолипидов и ионов Са2+. Тест может выпол-

няться как на специализированных фотометрах для исследования гемостаза, так и на обычных фотометрах и биохимических анализаторах. Ка­либровочная кривая для этого теста, как прави­ло, имеет линейный участок в широком диапазо­не концентраций фактора VIII.

Исследование с хромогенными субстратами позволяет надежно количественно определять не только дефицит, но и избыток активности ф. VIII. Это позволяет диагностировать и прогнозировать

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 105. Принцип определения содержания фактора VIII с использованием хромогенного субстрата. ФЛ - фосфо-липиды

развитие патологических тромбозов, поскольку увеличение в плазме активности фактора VIII рас­сматривается как фактор тромбофилии.

Методические и аналитические моменты (об­разование комплекса между фактором VIII и фак­тором Виллебранда (vWF) в дефицитной плазме, разные типы фосфолипидов, использование плаз­мы или концентратов и т. д.) могут приводить к систематическим различиям результатов между коагуляционными методами и методами с хромоген-ными субстратами при определении фактора VIII.

Более того, одна технология может выявлять па­тологию, а другая свидетельствовать о нормаль­ном содержании фактора VIII. Поэтому в насто­ящее время проводятся активные попытки стан­дартизации как коагуляционных, так и хромоген-ных методов определения фактора VIII. До вве­дения стандартизации рекомендуется метод с хро-могенными субстратами использовать толь­ко как ориентировочный и предпочтительно для оценки концентратов фактора VIII, а не с диаг­ностическими целями.

Определение фактора VII с использованием хромогенного субстрата

Фактор VII является слабой амидазой и не способен гидролизовать синтетические субстра­ты в плазме. Поэтому определение фактора VII проводится с помощью сопряженных реакций (рис. 106).

Фактор VII в пробе активируется тканевым фактором, фосфолипидами и ионами Са2+. Обра­зующийся комплекс ф. VII-ТФ-ФЛ-Са2+ активи­рует фактор X, активную форму которого опре­деляют тест-системой, аналогичной Pefachrome®. В то же время следует учитывать, что метод со-

пряженных реакций в случае определения факто­ра VII характеризуется существенным усилением сигнала, так как фактор VIIa приводит к актива­ции не одного, а нескольких десятков молекул фактора X.

Соотношение коагуляционного и хромогенно­го методов. Коагуляционный метод не всегда позволяет достаточно точно оценить активность фактора VII в плазме. Это связано с тем, что тка­невыми тромбопластинами активируется только часть фактора VII. Кроме того, разные тромбо-

Рис. 106. Принцип определения содержания фактора VII с использованием хромогенного субстрата. ТФ - тканевой фактор

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

пластины обладают разным активирующим эф­фектом, хотя полной активации фактора VII в пробе не удается достичь ни одним из тромбоп-ластинов. Еще одной причиной ошибок может быть способность ф. VII к нестимулированной и холодовой активации.

По-видимому, при оценке активности факто­ра VII с использованием хромогенных субстра­тов выявляется большее количество этого факто­ра, чем при использовании клоттинговых тестов. Клоттинговые тесты практически не выявляют

повышения фактора VII, а технология с хромо-генными субстратами способна определить его повышенное содержание в плазме. Исходя из того, что повышение фактора VII в плазме уве­личивает риск тромбоэмболической болезни, а лечение стероидами, беременность, сахарный ди­абет, состояние после инфаркта миокарда и ги-пертриглицеридемия сопровождаются повыше­нием активности фактора VII, методы с хромо-генными субстратами необходимо внедрять, что­бы оценивать риск тромбозов.

Определение протромбина (фактора II) с использованием хромогенного субстрата

. -■ --■ -------- ......

Протромбин достаточно надежно определя­ется коагуляционным методом. Однако опреде­ление протромбина с использованием хромоген­ного субстрата относительно хорошо стандарти­зовано. Кроме того, измерительный диапазон существенно расширяется при скрининге пациен­тов с протромбиновой мутацией G20210A, при которой увеличен риск тромбоэмболии. Про­тромбин активируется металлопротеазой экари-ном (фермент яда эфы многочешуйчатой) до ме-зотромбина - производное, которое не блокиру­ется гепарином и комплексом антитромбин-гепа­рин, но способно гидролизовать хромогенный субстрат (рис. 107) и свертывать не только обык­новенный фибриноген, но и некоторые тромбин-резистентные его производные (РКМФ).

PIVKA-протромбин активируется экарином, поэтому этот хромогенный тест может дать ложно-

завышенные результаты по активности протромби­на у пациентов, принимающих непрямые антикоа­гулянты или страдающих дефицитом витамина К. Примечание. PIVKA - Proteins Induced by Vita­min К Absence or Antagonists - протеины, синте­зируемые печенью при отсутствии витамина К или в присутствии его антагонистов (непрямых анти­коагулянтов). PIVKA не способны участвовать в процессе свертывания крови (см. раздел «Лечение антикоагулянтами непрямого действия».

Рис. 107. Принцип определения протромбина с исполь­зованием хромогенного субстрата

Определение фактора XIII

Исследование фактора XIII следует проводить в тех случаях, когда у больного имеются проявле­ния кровоточивости, но при этом ПВ, АЧТВ и тес­ты на первичный гемостаз нормальные. Среди ори­ентировочных и скрининговых тестов на недоста­точность ф. ХIII может указать только тромбоэлас-тограмма, на другие тесты дефицит ф. ХIII практи­чески не влияет. В то же время дефицит ф. ХIII име­ет выраженные клинические проявления и может быть причиной кровотечений неясной этиологии у человека на фоне полного здоровья, геморрагичес­кого синдрома при ДВС, гиперфибринолизе, после

удаления миндалин, при патологии печени и кост-но-мозгового кроветворения. Дефицит ф. ХIII мо­жет быть врожденным и приобретенным, в том чис­ле в результате появления аутоантител. Определе­ние дефицита ф. ХIII и его причины необходимо для назначения адекватного лечения, в частности ис­пользования концентратов фактора XIII. Для оп­ределения врожденного дефицита ф. ХIII использу­ются иммунохимические методы, в том числе ELISA, применяется ПЦР-диагностика для геноти-пирования врожденных мутаций. Однако ф. ХIII - это высокополиморфный белок, определение его

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

структурных компонентов часто бывает недоста­точным, поэтому требуются функциональные тес­ты с определением активности ф. ХIII.

Фотометрический метод

Фактор XIII - фермент трансглютаминаза, которая образует поперечные сшивки между пеп­тидами. При этом изопептидные связи образуют­ся между остатками глютамина и лизина, в реак­ции освобождается аммиак. Последний опреде­ляется в ферментной реакции с глютаматдегид-рогеназой (ГлДГ) и α-кетоглютаратом, кофакто­ром реакции является НАДН, окисляющийся до НАД (рис. 108). Измерение проводится фотомет­рически при длине 340 нм, метод может выпол­няться на биохимических анализаторах.

Инкорпорирующий метод