Лабораторная диагностика нарушений гемостаза (стр. 31 )

Преимущества использования хромогенных и флуорогенных субстратов:

•  Высокая чувствительность метода. pNA или
АМК обладают фотометрическими характе­
ристиками, позволяющими использовать ки­
нетические методы измерения.

•  Высокая специфичность. Для каждой отдель­
ной сериновой протеазы системы гемостаза
известна структура участка гидролиза. Моде­
лирование в короткоцепочечном пептиде спе­
цифической для конкретной протеазы после­
довательности из 3 аминокислот позволяет
исключить влияние других протеаз на резуль­
таты исследования. При синтезе хромогенных
субстратов для повышения специфичности
используются L - или D-стереоизомеры амино­
кислот, а также различные блокирующие груп­
пировки, чтобы предупредить деградацию их

неспецифическими аминопептидазами. Кроме того, в тестах используется концентрация хро­могенных субстратов в несколько сотен мкмоль/л, что существенно выше, чем констан­та Михаэлиса (Км) соответствующих фермен­тов, поэтому скорость реакции не зависит от концентрации субстратов. Факторы, которые необходимо учитывать при использовании хромогенных субстратов в практи­ческой клинико-диагностической лаборатории:

•  Растворимость субстратов должна быть хо­
рошей.

•  Реакция должна быстро достигать линей­
ность, чтобы использовать соответствующий
набор на биохимических анализаторах, в ко­
торых часто бывает ограниченным время
проведения измерения.

•  В пробе не должно быть мутности, которую
часто привносит фибрин или денатурирован­
ные белки.

Недостатки метода с использованием хромо­генных субстратов:

• Высокая стоимость реактивов.

• Возможное завышение результатов при иссле­
довании активности витамин-К-зависимых фак­
торов у лиц, получающих непрямые антикоа­
гулянты либо имеющих дефицит витамина К.
Некоторые хромогенные субстраты, исполь­
зуемые для определения активности факторов
свертывания, представлены в табл. 16.

Таблица 16

Типичные хромогенные и флуорогенные субстраты и ингибиторы, применяемые для выявления активности протеолитических ферментов системы гемостаза

 

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Иммунохимические методы

Иммунохимические методы активно начали внедряться в клинико-диагностических лаборато­риях с целью исследования гемостаза в последнее десятилетие. Они позволяют количественно оп­ределять концентрацию конкретного белка, что отличает их от коагуляционных методов и мето­дов с хромогенными субстратами, в которых оп­ределяется функциональная активность компо­нентов, а не их концентрация. Первые тест-сис­темы не позволяли различить активные и неак­тивные (профакторы) компоненты системы гемо­стаза. В последнее время предлагается все боль­ше тест-систем для определения концентрации активных компонентов свертывания, их кофак­торов, активаторов, ингибиторов, продуктов про-теолитического гидролиза, а также сформировав­шихся субстрат-ферментных комплексов. Эти те­сты основаны на использовании специфических антител. В современных клинико-диагностичес­ких лабораториях доступными стали иммунохи­мические методы для ручного и автоматизирован­ного использования, основанные на латекс-агг­лютинации (рис. 90) и методе ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

Латекс-агглютинация

Латекс-агглютинация выявляется визуально или на автоматизированных нефелометрах. Не-

достатком этого подхода является нелинейность оптического сигнала при турбидиметрическом и нефелометрическом методах регистрации.

Метод ELISA

Метод ELISA (рис. 91) для выявления кон­центрации факторов гемостаза, как правило, использует принцип «сендвича». На стенки мик­роплашки наносятся антитела к исследуемому фактору гемостаза (твердая фаза). После добав­ления плазмы происходит осаждение специфи­ческого антигена (белка системы гемостаза) на фиксированных антителах. Плашка промыва­ется и заполняется вторичными антителами, взаимодействующими с этим же белком, но по другим эпитопам (антигенным структурам). Вторичные антитела конъюгированы с фермен­том (ELISA), радиоактивной меткой (РИА), люминесцентной меткой (ЛИА). В тесте ELISA после отмывки несвязавшихся антител добав­ляется субстрат ферментативной реакции и хро­моген. Изменение светопропускания раствора пропорционально количеству антигена (факто­ра), осажденного на фиксированных антителах. Методика позволяет оценить этот параметр количественно в концентрации <1 нг/мл, что достаточно для многих компонентов свертыва­ющей системы.

Рис. 90. Принцип латекс-агглютинации. Латексные час­тицы, покрытые антителами против фактора гемостаза, при взаимодействии с этим фактором (антигеном) образуют агрегаты, видимые визуально или регистрируемые на со­ответствующих приборах

Рис. 91. Принцип ELISA. На плашке, покрытой антителами против фактора гемостаза, связывается антиген, Проявля­ющие антитела, конъюгированные с ферментом, связыва­ются с антигеном. Фермент меняет цвет хромогена про­порционально количеству антигена

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

В настоящее время значительное развитие получают быстрые качественные и полуколиче­ственные иммунохимические иммунодиффузион-ные методы, основанные на визуальном опреде­лении реакции антиген-антитело.

Радиальная иммунодиффузия

Метод радиальной иммунодиффузии (РИД) основан на образовании колец преципитации в результате взаимодействия специфических анти­тел, содержащихся в геле, с анализируемым ан­тигеном, помещаемым в углубления стандартно­го размера (рис. 92). В результате диффузии в геле растворимых антигенов кольцо преципитации образуется в зоне оптимального соотношения антиген/антитело. Площадь, ограниченная коль­цом преципитации, пропорциональна количеству антигена.

«Ракетный» иммуноэлектрофорез

«Ракетный» иммуноэлектрофорез - иммуноло­гический метод, сочетающий в себе электрофорез и иммунодиффузию (рис. 93). Метод дает возмож­ность различить сходные по электрофоретической подвижности вещества с помощью специфической реакции преципитации между антигеном, помеща­емым на гелевую (целлюлозо-ацетатную) пластин­ку, и соответствующими антителами, которые со­держатся в ней. Длина «ракетных» иммунопреци-питатов пропорциональна концентрации антиге­на. Метод довольно прост в исполнении и облада­ет относительно высокой точностью.

При фундаментальном подходе к исследовани­ям компонентов гемостаза применение флуоресцент­ной или люминесцентной меток повышает чувстви­тельность иммунохимических методов и расширяет спектр определяемых компонентов.

Ат	Ат	Ат
Ат		Ат
Ат	Ат	Ат

Ат	Ат	Ат
	Ат-Аг
Ат Щ	О	Ат
	Ат-Аг
Ат	Ат	Ат

Рис. 92. Принцип метода радиальной иммунодиффу­зии,

используемый для полуколичественной оценки неко - Рис. 93. Принцип метода «ракетный» иммуноэлектро-

торых факторов гемостаза форез

Скрининговые тесты оценки плазменного звена гемостаза

Лабораторная диагностика нарушений систе­мы гемостаза является одной из самых дорогосто­ящих в лабораторной практике. Выполнение всех возможных тестов для уточнения характера нару­шений для всех пациентов - практически недоступ­ная задача. Поэтому чрезвычайно важно соблю­дать этапность проведения тестов, исходить из клинических данных и анамнеза пациента.

На первом этапе для уточнения направленнос­ти нарушений необходимо провести тесты, отража­ющие состояние целых звеньев системы гемостаза. Поскольку в разных лабораториях при анализе ге­мостаза преследуются разные цели, перечень тестов, входящих в гемостатический скрининг для данной лаборатории, может отличаться от такового в дру-

гих лабораториях. Однако существует набор тестов, традиционно называемых (и рекомендуемых) скри-нинговыми для диагностики состояния системы ге­мостаза. Обычно к ним относят определение вре­мени кровотечения и несколько тестов, оцениваю­щих состояние плазменного звена гемостаза, кото­рые входят как основной компонент в понятие коа-гулограммы. Наиболее полно этапность разработа­на для диагностики геморрагических нарушений. Скрининговые тесты:

•  Время кровотечения.

•  Количество тромбоцитов.

•  АЧТВ.

•  Протромбиновое время (по Квику).

•  Тромбиновое время и/или фибриноген.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Для пациентов с тромботическими заболева­ниями адекватного скрининга для диагностики нарушений системы гемостаза не разработано. Имеет смысл проведение исследования наиболее значимых маркеров тромбофилии, о которых бу­дет говориться ниже. Однако есть возможность контроля активности самого процесса патологи­ческого тромбообразования на основе анализа концентрации маркеров тромбообразования.