Лабораторная диагностика нарушений гемостаза (стр. 29 )

В настоящее время разработаны достаточно компактные тромбоэластографы, которые мож­но размещать на каталке около постели больно­го и оценивать процесс гемостаза немедленно после взятия крови, что существенно уменьшает влияние преаналитических факторов. Один из наиболее адаптированных к клиническим иссле­дованиям тромбоэластографов «Rotem Gamma» показан на рис. 82.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

 

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Молекулярно-биологические методы

Высокоинформативным методом, сочетаю­щим иммунохимические технологии с исследо­ванием клеточных популяций, является проточ­ная цитометрия. Проточная цитометрия позво­ляет охарактеризовать клеточные популяции, их размеры, стадию дифференцировки. Этим мето­дом определяют наличие или отсутствие на кле­точной поверхности специфических рецепторов или продуктов клеточной активации, субпопу­ляции тромбоцитов и даже циркулирующие эн-дотелиальные клетки. Метод возможен при на­личии проточного цитометра и специфических реактивов, в первую очередь моноклональных антител. Основным достоинством этой техноло­гии является возможность разделить клеточные популяции на активированные и неактивные. Тем не менее использование данной технологии для оценки гемостаза используется крайне ред­ко, так как технология дорогая и требуется вы­сококвалифицированный персонал, подготов­ленный в области проточной цитометрии и ге-мостазиологии.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) начина­ет внедряться в лаборатории, занимающиеся ге-

мостазом, в первую очередь наследственными нарушениями свертывания крови. Наследствен­ные заболевания связаны с отсутствием или дис­функцией белков в результате мутаций в генах, кодирующих их синтез. Задачей молекулярно-биологических методов является выявление этих мутаций. Обширные молекулярно-генетические исследования проводятся при диагностике гемо­филии А и В, а также болезни Виллебранда. ПЦР используется для выявления мутаций фактора V Лейден, протромбина 20210G→A, полиморфиз­ма фактора XIII, дефицита AT, протеинов С и S и в других случаях. ПЦР и другие методы моле­кулярной и генной диагностики используются для выявления наследственных заболеваний, при ко­торых нарушения гемостаза являются сочетанной формой патологии.

Эти методы играют очень важную роль в пре-натальной диагностике, объектом для исследова­ния может быть амниотическая жидкость или хорион, которые можно получить на 8-10-й не­деле беременности. Этими исследованиями мож­но выявить гетерозиготное и гомозиготное носи-тельство патологических генов.

Методические основы лабораторной оценки плазменного гемостаза

Коагуляционные методы

Коагуляционные, или клоттинговые, методы основаны на определении промежутка времени от добавления стартового реактива, запускающего каскад свертывания плазмы, до момента образо­вания сгустка (выпадения фибрина). При поста­новке коагуляционных тестов необходимо пере­мешать плазму с реактивом до гомогенной сус­пензии и поддерживать стабильной температуру реакции. Коагуляционные тесты - в настоящее время наиболее распространенный методический подход для оценки плазменного гемостаза в кли­нико-диагностических лабораториях. Необходи­мо подчеркнуть, что коагуляционные методы яв­ляются скрининговыми, тем не менее на их осно­ве сконструирован ряд методов для оценки актив­ности факторов плазмы.

Ручные методы

Ручные методы обнаружения момента выпа­дения сгустка проводятся на водяной бане. Авто­матическая регуляция температуры воды только частично решает проблему поддержания посто­янной температуры. Частое вынимание пробир­ки во время исследования для наблюдения за по­являющимся сгустком является причиной того, что температура реакции не соответствует тем­пературе водяной бани. При визуальной оценке времени появления сгустка даже опытному лабо­ранту невозможно точно установить момент по­явления сгустка, что является главной причиной плохой повторяемости результатов. Однако сле­дует помнить, что в ситуациях, в которых отсут­ствуют или подводят автоматические методы

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

(формируется неплотный сгусток), применение этого метода обоснованно.

Точность определения времени больше зави­сит от исследователя, чем от типа используемого в исследованиях секундомера. Удовлетворитель­ной следует считать точность определения време­ни до 0,5 с. К недостаткам этого метода можно отнести длительность его выполнения и необхо­димость максимального внимания во время про­ведения исследования.

Автоматизированные коагулометры

Автоматизированные коагулометры суще­ственно улучшили точность и повторяемость ре­зультатов коагуляционных тестов, уменьшили влияние человеческого фактора. В настоящее вре­мя имеется большой выбор различных приборов для исследования гемостаза, начиная от самых простых, в которых автоматизирован лишь про­цесс фиксации момента свертывания крови, до сложных машин, требующих лишь установить отцентрифугированные пробирки в штатив и за­дать программу исследований. В последние годы появляются биохимические анализаторы, в кото­рых предлагаются программы для регистрации коагуляционных тестов методом турбидиметрии по резкому изменению светопропускания в мо­мент свертывания плазмы. Все это значительно расширило возможности оценки гемостаза в кли­нико-диагностических лабораториях. В то же вре­мя исследование гемостаза по-прежнему предъяв­ляет высокие требования к преаналитическому этапу, качеству подготовки проб, квалификации лаборантов, проводящих исследования.

В последние несколько лет в аналитическом подходе к оценке гемостаза, в том числе и из-за внедрения автоматизации, существенно повыше­ны требования к стандартизации. Стандартиза­ция рассматривается как спектр приемов иссле­дования гемостаза, обеспечивающий воспроизво­димые в разных лабораториях результаты за счет применения разовых систем взятия крови, аттес­тованных методов, реактивов, приборной базы, международных стандартов при калибровке, про­ведения внутрилабораторного контроля качества, участия во внешнем и международном контроле качества и др. Наиболее ярким примером такого подхода является переход от определения нестан-

дартизованного протромбинового индекса к оп­ределению международного нормализованного отношения (MHO) при использовании аттесто­ванного по международным стандартам тромбоп-ластина (см. ниже). Однако многие коагуляцион-ные методы плохо поддаются стандартизации, в том числе такой широко распространенный тест, как активированное частичное тромбопластино-вое время (АЧТВ).

В основе регистрации момента выпадения сгустка в коагулометрах используются несколь­ко принципов: механический, турбидиметричес-кий, оптико-механический. Каждый из них име­ет свои преимущества и недостатки, которые важ­но знать при интерпретации результатов иссле­дований (см. ниже).

Ограничения коагуляционных методов:

•  Ограниченное время регистрации. Тест дол­
жен быть проведен в течение примерно 10-
200 с. Это возможно далеко не для всех ана­
лизов.

•  Далеко не все компоненты гемостаза можно
исследовать по времени образования сгуст­
ка. Компоненты системы фибринолиза, инги­
биторы не оказывают прямого влияния на
время свертывания, и их количественная
оценка не поддается исследованию клоттин-
говым методом.

•  Метод чувствителен к различным неспеци­
фическим внешним воздействиям. Напри­
мер, исследование активности ф. VIII клот-
тинговым методом невозможно у пациента,
получающего терапию гепарином или непря­
мыми антикоагулянтами, хотя ни те ни дру­
гие не оказывают непосредственного влия­
ния на этот фактор.

•  Метод малочувствителен для определения
повышенной активности компонентов систе­
мы свертывания крови.

•  Для ряда тестов сложно создать устойчивые
реактивы, удобные для применения в диаг­
ностических лабораториях. Существенной
проблемой на этом пути является использо­
вание активаторов плазменных факторов, в
частности использование на первом этапе ак­
тиваторов протеолитических реакций. Акти­
ваторы могут быть нефизиологическими, ко­
торые имитируют твердую фазу поверхнос­
ти (каолин, целит), или физиологическими

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

(экстракты тканей, очищенные или рекомби-нантные активаторы факторов свертыва­ния). Несколько этапов свертывания требу­ют не только активаторов, но и кофакторов свертывания, фосфолипидов и ионов Са2+. Для практических целей применяются сме­си этих веществ, часто с нестабильными бел­ками, которые иногда трудно очистить и ста­билизировать (например, тромбин). В учреж­дениях с высоким научным потенциалом часто применяются активаторы на основе змеиных ядов. Эти натуральные активаторы зачастую превышают по своим характерис­тикам даже высокоочищенные и рекомби-нантные активаторы. Они бывают устойчи­выми к действию ингибиторов и прямых ан­тикоагулянтов, часто не требуют кофакто­ров и ионов Са2+. Однако использование та­ких активаторов ограничено высокой сто­имостью и малой доступностью для практи­ческих лабораторий.

Механические коагулометры

Принцип работы механических коагуломет-ров представлен на рис. 83. В одном из вариан­тов кювета с плазмой вращается в наклонном

Рис. 83. Принцип работы механического коагуломет-

ра. Кювета с плазмой расположена под наклоном и вра­щается, шарик стоит на месте, не вращается. В момент свертывания шарик захватывается сгустком; как только шарик уходит от датчика, меняется магнитное поле, при­бор регистрирует момент свертывания плазмы

положении. Металлический шарик в кювете нач­нет вращаться при свертывании плазмы. Момент захвата шарика выпавшим сгустком и начало его вращения вместе с кюветой фиксируется магнит­ным датчиком. При других вариантах регистри­руется прекращение вращения внутри кюветы магнитной мешалки, захват сгустка опускаю­щимся в кювету крючком или иные схемы, ос­нованные на переходе жидкой плазмы в сгусток. Механические коагулометры характеризуются высокой надежностью и простотой в обслужи­вании. Кроме того, они могут работать с цель­ной кровью. Основные проблемы возникают в ситуациях, когда формируется неплотный сгус­ток, например при использовании гепарина. В этих случаях выпадающий фибрин часто не мо­жет сразу увлечь за собой механическое устрой­ство, результаты получаются плохо воспроизво­димыми. Другой проблемой является формиро­вание на шарике, мешалке или других устрой­ствах, погруженных в кювету, белковых конгло­мератов, которые мешают регистрации.