Лабораторная диагностика нарушений гемостаза (стр. 38 )

Разработан новый метод определения фак­тора XIII, основанный на введении субстрата в

иммобилизированный белок, которое обеспечи­вается фактором ХIIIа. Раньше иммобилизо­вался казеин. В новом методе используется физиологический субстрат-фибрин. Фактор ХIIIа инкорпорирует субстрат 5-(биотинамидо)-пен-тиламин (БАПА) в фибрин, который определя­ется количественно с конъюгатом стрептави-дин-щелочная фосфатаза (рис. 109). Инкорпо­рирующий метод позволяет оценивать физиоло­гическую роль мутации Val34Leu фактора XIII, которая сочетается с риском внутричерепных кровоизлияний и кровотечений из внутренних органов. В то же время больные с этой мутаци­ей фактора XIII практически не страдают ин­фарктом миокарда и венозными тромбозами. Мутацию Val34Leu фактора XIII не выявляет фотометрический метод. Инкорпорирующий метод может с успехом использоваться для мо-ниторирования больных с очень низким уров­нем ф. ХIII, что бывает при наследственных де­фицитах.

 

Рис. 108. Принцип определения фактора XIII фотометрическим методом

Рис. 109. Принцип определения фактора XIII инкорпорирующим методом. БАПА - 5-(биотинамидо)-пентиламин, ЩФ-щелочная фосфатаза

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Тесты для определения гепарина

Антикоагулянты прямого действия широко используются для профилактики и лечения тром-боэмболической болезни. Традиционный тест АЧТВ полезен для контроля за лечением гепари­ном, когда гепарин применяется в относительно низких концентрациях (описан выше). При вы­соких дозах гепарина, например при операциях на открытом сердце или при диализе, АЧТВ не позволяет следить за эффектами гепарина. Анти-коагулянтное действие низкомолекулярного гепа­рина АЧТВ не улавливает.

Определение гепарина

с помощью хромогенных субстратов

Синтетические субстраты применяются для определения гепарина, особенно при использова­нии низкомолекулярного гепарина (НМГ). Гепа­рин определяется опосредованно: используется его способность усиливать комплексообразование ф. Ха или тромбина с антитромбином и тем самым подавлять активность этих протеаз, после чего оп­ределяется их остаточная активность (рис. 110). Тест с определением остаточной активности ф. Ха («анти-Ха-активность») применяется при контро­ле за лечением короткоцепочечным фракциони­рованным гепарином, который обладает большей тропностью к ф. Ха, чем к тромбину. Кроме того, ф. Ха - относительно стабильный фермент, поэто­му тест с использованием этого фактора техни­чески более надежный, чем тест с активным тром­бином.

Тест может выполняться в разных модифи­кациях: как кинетический метод, определение по начальной скорости или метод по конечной точке. В некоторых тестах используется насы­щающая концентрация AT, тогда тест обозна­чается как «общий гепарин», в других - исполь-

зуется эндогенный AT пробы, в этих случаях тест обозначается как набор для определения комплекса гепарин-АТ, или «активный гепа­рин». Определение гепарина с использованием хромогенных субстратов легко адаптируется для автоматических биохимических анализато­ров. На результаты теста с хромогенными суб­стратами не оказывают влияния продукты дег­радации фибрина (ПДФ) и повышенное содер­жание ф. VIII, которые меняют результаты при определении АЧТВ.

Для тестов на определение гепарина разра­ботаны и промышленно выпускаются калибра­торы - лиофильно высушенные препараты плаз­мы со стандартным содержанием гепарина. Ка­либраторы должны быть тестированы по стан­дарту ВОЗ, которому придано значение актив­ности 1,0 анти-Ха-Ед/мл. Терапевтический диа­пазон для лечения гепарином рекомендуется в пределах 0,3-0,7 анти-Ха-Ед/мл.

Определение гепарина

с помощью коагуляционных методов

Принцип определения гепарина с использо­ванием коагуляционных тестов подобен таково­му в тестах с хромогенными субстратами. Опре­деление основано на ингибировании свободного ф. Ха на первом этапе. После инкубационного периода выпадение сгустка вызывается добавле­нием реактивов, содержащих фосфолипиды с ад­сорбированными на них фактором V, протром­бином, фибриногеном из бычьей плазмы и СаС12 (рис. 111). Автоматизация этого метода затруд­нена, так как сигнал достаточно слабый для оп­тического метода. Тест может выполняться на цельной крови на коагулометрах с механической системой регистрации.

Рис. 110. Принцип определения содержания гепарина с использованием хромогенного субстрата, AT - антитромбин

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

 

Рис. 111. Принцип определения содержания гепарина коагуляционным методом

Преаналитические факторы, влияющие на результаты определения гепарина

Качество подготовки пробы - существенный фактор, влияющий на результаты определения гепарина. Нарушение взятия крови из локтевой вены может сопровождаться активацией тромбо­цитов in vitro, что приведет к ложным результа­там с недооценкой содержания гепарина в крови больных. При активации тромбоцитов освобож­дается фактор 4 тромбоцитов (PF4). PF4 высту­пает как естественный антигепарин, нейтрализу-

ющий как нефракционированный, так и низко­молекулярный фракционированный гепарин (НМГ), хотя следует отметить, что НМГ менее чувствителен к подавляющему действию PF4.

Для предупреждения этого эффекта и подав­ления активации тромбоцитов при транспорти­ровке крови рекомендуется использовать специ­альные пробирки для крови, например CTAD tubes, в которых содержится цитрат, теофиллин, аденозин, декстроза - «коктейль», который пре­дупреждает активацию тромбоцитов.

Методы для определения резистентности к активированному протеину С,

активности протеина S, антитромбина, антифосфолипидных антител

 

Резистентность к протеину С

Термин «резистентность к протеину С» вве­ден при описании феномена практического отсут­ствия удлинения АЧТВ после добавления акти­вированного протеина С (рис. 112). Устойчивость (резистентность) ф. Vа к ингибирующему воздей­ствию активированным протеином С (РАПС) - один из серьезных факторов риска патологичес-

Рис. 112. Резистентность к активированному протеи­ну С (АПС) при мутации в гене, контролирующем синтез фактора V, которая приводит к образованию фактора Лейден. Тест основан на определении АЧТВ

ких тромбозов. РАПС - нарушение функциони­рования системы протеина С.

Факторы, которые влияют на РАПС, представ­лены в табл. 26. РАПС может быть как врожден­ной, так и приобретенной. В случае наследования РАПС гетерозиготы имеют риск развития тромбо­зов примерно в 7 раз, а гомозиготы - в 80 раз выше, чем в среднем по популяции. РАПС была обнару­жена среди 20% больных с первичным тромбозом глубоких вен бедра и среди 40% больных тромбо-филией. По разным данным от 20 до 60% больных с тромбозом глубоких вен бедра имеют РАПС.

Таблица 26

Факторы, влияющие на резистентность к АПС

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Скрининговые тесты на АПС разработаны на основе модифицированного теста АЧТВ, кото­рый проводится с и без АПС, или на основе ПВ со змеиным ядом.

Тест резистентности фактора Va к АПС на основе модифицированного АЧТВ

Добавление АПС в норме вызывает удлине­ние АЧТВ за счет инактивации факторов Va и Villa в плазме. Поэтому в тесте сравнивается вре­мя выпадения сгустка в тесте АЧТВ с добавлени­ем и без добавления АПС и рассчитывается от­ношение (рис. 114). Референтные значения теста зависят от используемых реактивов и приборов. Тем не менее, несмотря на разные методы и при­борную базу, обычно добавление АПС к плазме приводит, по крайней мере, к 2-кратному удли­нению АЧТВ (табл. 27).

Недостаточное удлинение АЧТВ (патологи­ческий результат, свидетельствующий о РАПС) наблюдается у пациентов с фактором V Лейден, волчаночным антикоагулянтом, при беременно­сти, увеличенном содержании фактора VIII и при-

еме оральных контрацептивов. Этот тест имеет специфичность для выявления фактора V Лейден примерно 80%, неполная специфичность связана с влиянием на результат других факторов, в част­ности с подавлением активности фактора VIIIa. На результаты теста оказывают влияние прием не­прямых антикоагулянтов и введение гепарина. Тест полезен для выявления пациентов с высоким риском тромбоэмболической болезни.