Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 14 )

Рис. 34. Формы колоний (вид сверху)

зование глубинных колоний сопровождается разрывом плотной среды. Еще менее характерны донные колонии, образующиеся при соприкосновении агаризованной среды с дном чашки Петри. Эти колонии обычно имеют вид довольно крупных бесцветных прозрачных налетов.

Описание колонии часто дополняют характером роста микро­организмов по штриху на поверхности скошенной плотной пита­тельной среды. При этом отмечают его интенсивность — скудный, умеренный, обильный и особенности — налет сплошной с ровным или волнистым краем, четко видный в виде цепочки изолирован­ных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ризоид

Рис. 35. Формы колоний (вид сбоку)

ный. Отмечают оптические свойства штриха, его цвет, поверх­ность и консистенцию. При описании колонии и роста микроор­ганизмов по штриху обязательно указывают состав среды и воз­раст культуры, так как колонии одного и того же микроорганизма на различных средах могут отличаться рядом признаков. В опреде­лителях обычно приведены описания колоний и роста микроорга­низмов по штриху только на мясопептонном агаре или на мясо-пептонном агаре и мясопептонной желатине.

Рост на картофеле. Многие микроорганизмы растут на ломтиках картофеля и образуют налеты, характерные для представителей данного вида. Особенность роста на картофеле является диагностическим признаком и играет определенную роль при идентификаций. Ломтики картофеля подготавливают в качестве среды следующим образом. Клубни тщательно моют во­дой, очищают от кожуры и пробочным сверлом вырезают кусоч­ки в форме цилиндра длиной 4...5 см. Цилиндры разрезают по диагонали (на клинья) и для нейтрализации клеточного сока по­гружают на 1 ч в 1%-й раствор гидрокарбоната натрия (NaHCO3) или скошенную поверхность картофеля натирают мелом. После этого кусочки картофеля помеща

ют в пробирки, на дно которых предварительно положена вата, смоченная водой. Стерилизуют картофель при 50кПа.

Рис. 36. Края колоний (вид под микроскопом)

Посев делают петлей, втирая посевной материал в скошенную поверхность картофеля. Отмечают рост микроорганизмов или его отсутствие. Если рост есть, то указывают его интенсивность и ха­рактерные особенности, используя те же признаки, что и при опи­сании роста па плотных средах. Особое внимание обращают на образование пигмента.

Рост в жидкой среде. Рост микроорганизмов в жид­ких питательных средах при стационарных условиях культивиро­вания характеризуется большим единообразием по сравнению с ростом на плотных средах. Он сопровождается помутнением сре­ды, образованием пленки или осадка. Отмечая особенности роста в жидких средах, указывают прежде всего его интенсивность: скудный, умеренный или обильный. Помутнение среды может быть однородным, хлопьевидным или с шелковистой волнистос­тью.

Если образуется пленка, указывают ее особенности: кольцеоб­разная или сплошная, тонкая или толстая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая, сухая или слизистая, всползающая или опадающая.

При образовании осадка характеризуют его свойства: скудный или обильный, рыхлый, плотный, хлопьевидный, зернистый или слизистый. Обычно для того чтобы охарактеризовать рост в жид­кой среде, используют МПБ. Если изучаемый микроорганизм не растет в МПБ, то подбирают такую жидкую среду, которая под­ходит для него. Рост в МПБ и в жидких средах описывают, ис­пользуя 4...7-суточные культуры, выращенные в стационарных условиях.

Тема 6. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МИКРОБОВ

Чистой культурой называют микроорганизмы одного вида, вы­росшие на питательной среде отдельно от других видов. Часто употребляемый термин разновидность применим к микроорганиз­мам определенного вида, но отличающегося от последнего каким-либо одним признаком. Штаммом называют культуру одного вида микробов, выделенную из конкретного источника (из органов жи­вотного, из корма, пробы почвы, воды и других объектов). Клон — культуры микробов, происходящие из одной клетки.

Выделение чистой культуры. Метод Дригальского. Берут несколько чашек Петри со стерильным МПА, в одну из них на поверхность агара наносят каплю смеси бактерий. Специаль­ным шпателем или пастеровской пипеткой, изогнутой на огне го­релки в виде шпателя, растирают каплю по поверхности агара, закрывают крышкой чашку. Этим же шпателем растирают поверх­ность другой чашки, затем третьей, четвертой и т. д. Чашки помещают в термостат, перевернув вверх дном, чтобы образующийся конденсат не смывал культуру. Самый густой рост будет в первой чашке, в последней чашке обычно получают изолированные друг от друга колонии. Колонии изучают по их внешнему виду, из них готовят бактериологический препарат, окрашивают и микроско-пируют. Отобрав колонию с характерными признаками и соот­ветствующими морфологическими, тинкториальными свойства­ми для искомого вида возбудителя, из нее бактериологической петлей производят посев в пробирки с МПБ и МПА (отвивка, пересев колонии) для получения чистой культуры одного вида микробов.

Для выделения чистой культуры бактерий часто используют метод, основанный на неодинаковом воздействии химических ве­ществ, антибиотиков, добавленных к питательным средам, на раз­витие разных видов микробов. Эти вещества, угнетая рост одних видов, не влияют на рост других. На этом принципе основано применение многих элективных сред с красками: яично-крах-мальные среды для выделения микобактерий туберкулеза, глюко-зо-печеночная среда с генцианвиолетом (или кристаллвиолетом) для получения роста бруцелл и подавления роста других видов микроорганизмов.

Метод Пастера. Основан на последовательном разведе: нии в 10 пробирках с жидкой средой капли смеси бактерий с рас­четом получить в последней пробирке чистую культуру. Кох, вве­дя в лабораторную практику использование плотных сред, приме­нил принцип Пастера, но разведения производил в плотной рас­плавленной среде и содержимое каждой пробирки с разным количеством исследуемого материала выливал в отдельную чашку Петри. После выдерживания в термостате в последних чашках с наибольшим разведением обнаруживают изолированные колонии. Пересеяв отдельную колонию в среды в пробирках, культивируя в термостате, получают чистую культуру. При исследовании воды, молока, фекалий и других материалов используют методы, пред­ложенные Пастером и Кохом.

При выделении спорообразующих микроорганизмов, учитывая стойкость спор при нагревании, исследуемый материал (или смесь выросших разных культур) прогревают в водяной бане при 80 °С в течение 30 мин, при этом все вегетативные формы погибают, а споры сохраняются. После прогревания производят пластинчатый посев по Дригальскому с последующей отвивкой колонии. Поми­мо этого метода при выделении культуры спорообразующего па­тогенного вида микроба прибегают к биопробе: после прогрева­ния смесь микробов вводят подкожно лабораторному животному (белая мышь, морская свинка); через 1...3сут животное гибнет. Труп вскрывают и из разных внутренних органов пастеровской пипеткой производят посев на питательные среды для получения чистой культуры возбудителя.

Нередко для выделения чистой культуры подвижных видов бактерий используют метод Мечникова и Шукеви-ч а. Каплю исследуемого материала помещают на дно пробирки со скошенным агаром (обязательно в конденсационную воду). Если в смеси с разными бактериями будет находиться подвижный вид микроба (протей, столбнячная палочка и др.), то через 12... 18 ч на поверхности агара появляется рост бактерий искомого вида, пересевом которого с самой верхней части агара достигается получение чистой культуры. Для выделения анаэробов посевы на средах в пробирках, чашках Петри помещают в эксикатор или анаэростат.

Биохимические свойства микробов. Для описания и идентифи­кации микроорганизмов широко используют некоторые особен­ности их обмена веществ, выявляемые по способности расти на диагностических средах и вызывать те или иные превращения ве­ществ, входящих в состав этих сред. К биохимическим признакам, которые, как правило, необходимы при определении системати­ческого положения различных представителей бактерий, относят способность использовать углеводы, сахара и спирты. Микроорга­низмы характеризуются неодинаковой способностью использо­вать различные углеводы и спирты в качестве единственных ис­точников углерода и энергии.

Для идентификации большинства гетеротоофных микроорга­низмов необходимо определить, какие углеводы и спирты обеспе­чивают рост изучаемого организма и какими изменениями среды он сопровождается. Как правило, для этих целей используют сле­дующие углеводы — арабинозу, ксилозу, глюкозу, фруктозу, га­лактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, а также спирты— глицерин и маннит. Рост на средах с этими соединениями может приводить к накоплению органических кислот, нейтральных продуктов, газов.

Образование кислот регистрируют по изменению активной кислотности (рН) среды, газа —по появлению на поверхности среды пены и вытеснению среды из поплавка. Углеводы или спир­ты составляют 1 % основного состава среды. Основой (фоном) среды является водопроводная вода; в нее входят 0,5 % пептона и 0,1 % КНРО4. Чтобы обнаружить изменение рН, к среде добавля­ют индикатор бромкрезолпурпур из расчета 2 мл 1,6%-го спирто­вого раствора на 1 л среды: при рН 6,8 индикатор имеет пурпур­ный, а при рН 5,2 —желтый цвет. Вместо бромкрезолпурпура можно использовать в такой же концентрации бромтимолблау, который при рН 6,0 дает желтый цвет, а при рН 7,6 — синий.