Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 45 )

Биопробу используют для определения патогенности и диффе­ренциации видов бактерий туберкулеза. Заражают морских свинок, кроликов и при необходимости кур, предварительно проверенных аллергическим методом для исключения спонтанного туберкулеза. Для заражения применяют выделенную культуру или присланный в лабораторию материал. Последний предварительно обрабатывают по Гону серной кислотой, как указывалось выше, растирая в сте­рильной ступке. Затем к осадку после центрифугирования добавля­ют 15%-й раствор гидрокарбоната натрия (двууглекислой соды), ос­тавляют на 10...15 мин и вновь центрифугируют 5 мин. Образовав­шийся осадок дважды промывают стерильным физиологическим раствором NaCl с последующим центрифугированием, а затем оса­док вновь эмульгируют в физиологическом растворе, отстаивают 5... 10 мин. Надосадочную жидкость вводят в дозе 1...2мл: морским свинкам в паховую область, кроликам — внутривенно.

У морских свинок в положительных случаях через 2...3нед на месте введения образуется уплотнение, затем язва с одновремен­ным увеличением регионарных лимфоузлов. Далее этим свинкам через 2...3 нед подкожно вводят туберкулин, что приводит к бурной генерализации процесса и гибели животных. При вскрытии из ти­пичных туберкулов готовят мазки и делают посевы. М. bovis вызы­вает генерализованный процесс туберкулеза у кроликов и морских свинок. М. tuberculosis патогенны лишь для морских свинок, вызы­вая заболевание в период от 3 нед до 3 мес после заражения. М. avium, как правило, обусловливает у кроликов септический процесс без образования специфических бугорков и приводит к быстрой ги­бели животных (особенно при внутривенном заражении).

Дифференциация. Для дифференциации отдельных видов микобактерий лучше заражать животных суспензией выра­щенных культур. Если у выделенных культур слабая вирулент­ность и атипичный рост, то микобактерий необходимо дифферен­цировать от кислотоустойчивых сапрофитов. Для этого использу­ют следующие тесты:

1. Определение каталазной активности. В пробирку с вырос­
шей культурой на яичной среде вносят 50%-й раствор пергидро­
ля, чтобы вся поверхность среды с культурой была покрыта. С
момента появления пузырьков газа учитывают результат — стол­
бик пены измеряют в миллиметрах (мм). Каталазной активнос­
тью обладают все кислотоустойчивые бактерии, но у сапрофитов
она интенсивнее.

2.  Определение лекарственной устойчивости. Осуществляют с
культурами, выращенными на питательных средах с добавлением
различных концентраций туберкулостатических препаратов
(стрептомицин, ПАСК и др.). Вирулентные штаммы М.
tuberculosis, M. bovis, как правило, чувствительны к действию этих
препаратов. Между тем атипичные штаммы, кислотоустойчивые
сапрофиты и М. avium обладают устойчивостью в отношении ан­
титуберкулезных лечебных препаратов, особенно к фтивазиду и
ПАСК (парааминосалициловая кислота).

Аллергический метод используют в хозяйстве как метод массо­вой диагностики скрытых форм туберкулезного процесса. С этой целью применяют специфические препараты — туберкулин для крупного рогатого скота и отдельно для птиц.

Возбудитель паратуберкулезвого энтерита крупного рогатого ско­та (Mycobacterium paratubercutosis). Вызывает заболевание преиму­щественно у крупного рогатого скота, реже у овец, верблюдов и очень редко у коз и оленей. Паратуберкулез — хроническая ин­фекционная болезнь, характеризующаяся образованием отечно-воспалительных складок слизистого и подслизистого слоя пора­женного участка кишечной стенки под действием локализованно­го здесь возбудителя. Характерные клинические признаки болез­ни — профузный понос и прогрессирующее истощение.

Лабораторная диагностика. При жизни живот­ного посылают фекалии с комочками слизи и примесью крови, со-скобы со слизистой оболочки прямой кишки; посмертно (или при убое) исследуют пораженные участки кишечника, отрезок под­вздошной кишки, перевязанный с двух сторон, мезентериальные лимфатические узлы. Материал берут с соблюдением правил асеп­тики, консервируют в 30%-м растворе глицерина. Для гистологи­ческого исследования консервируют в 10%-м растворе формалина.

Бактериологический анализ. Включает в себя микроскопию мазков из патологического материала и выделение чистой культуры возбудителя паратуберкулеза. Основным ориен­тиром служит результат микроскопирования препаратов, так как выделение чистой культуры возбудителя сопряжено с большими трудностями. Биологическую пробу на паратуберкулез не ставят, т. к. лабораторные животные не восприимчивы. Можно использо­вать телят.

Подготовка материала. Учитывая загрязненность материала посторонней микрофлорой, его предварительно обрабатывают с целью очистки и концентрации возбудителя, как и при диагности­ке туберкулеза, а также применяют способы Венота и Моро или метод флотации.

Метод Венота и Моро: 2...4 г фекалий растирают в стерильной ступке, добавляют 25%-й раствор NaCl до жидкой консистенции и фильтруют через двойной слой марли. Фильтрат сливают в цент­рифужные пробирки, добавляют по 1 мл петролейного эфира (можно бензин или лигроин), взбалтывают, центрифугируют 15...20 мин при 3000 мин-'. Мазки готовят из нижней части надо-садочного слоя жидкости.

Микроскопия. M.paratuberculosis— мелкая палочка дли­ной 0,5... 1,5 мкм и шириной 0,2...0,5 мкм, неподвижная, споры и капсулы не образует, кислотоустойчивая, грамположительная. В препаратах из патологического материала располагается кучками, гнездами, редко одиночно или по 2...4 клетки. Отмечается поли-морфность: палочки могут иметь расширение, приобретая конту­ры бутылки, ручной гранаты, бесструктурных глыбок, мелких кок­ков. В мазках из культуры палочки длиннее, стройнее, скучен­ность меньшая, в некоторых видна зернистость.

В связи с тем что выделение возбудителя паратуберкулеза с фе­калиями происходит периодически, при сомнительном или отри­цательном результате микроскопии исследование повторяют.

Кроме обычной световой используют люминесцентную микро­скопию препаратов-отпечатков из патологического материала или полученной чистой культуры, используя специфические люми-несцирующие сыворотки.

Выделение чистой культуры. Осуществляют по­севом на специальные питательные среды, так как на обычных средах возбудитель паратуберкулеза не растет. Активный рост наблюдают при добавлении к питательным средам вытяжки из уби­тых бактерий туберкулеза или кислотоустойчивых сапрофитов. М. phlei выращивают на среде Данкинса: в 4%-м глицериновом бульо­не растирают 10 мл глицерина и 10 мл печеночного экстракта, ки­пятят, добавляют три свежих яйца, хорошо перемешивают, вносят спиртовой раствор генцианвиолета (2,5 % к общему объему сре­ды), фильтруют, разливают в пробирки, скашивают и стерилизуют в аппарате для свертывания сывороток дробно в течение 3 сут под­ряд при 80°С по 1 ч.

Патологический материал. Предварительно об­рабатывают 5%-м раствором серной кислоты, промывают физио­логическим раствором NaCl, растирают в ступке и высевают на среды. Посевы помешают в термостат при 38 °С; через 2 сут про­бирки парафинируют. Учет производят с помощью лупы через 15 сут, а затем каждые 5 сут. Первичный рост на казеиновой среде наблюдают к 18...20 сут при сильной обсемененности засеянной ткани; при слабой обсемененности — в более поздние сроки. На плотных элективных средах колонии плоские, сухие, серовато-бе­ловатые, с неровными краями. По мере роста края приобретают бугристость, не отличаясь от колоний других микобактерий. В жидких средах (МПБ с глицерином, синтетических средах) на по­верхности образуется нежная беловатая пленка, которая в силу собственной тяжести опускается на дно.

Дифференциация. Возбудитель паратуберкулезного эн­терита дифференцируют от возбудителя туберкулеза по следующим тестам: 1) культивирование микобактерий паратуберкулеза возмож­но только на средах с добавлением «фактора роста»; 2) лаборатор­ные животные невосприимчивы к возбудителю паратуберкулеза.

Серологическая диагностика. Пробы сывороток крови исследуют в РСК по общепринятой методике (с паратуберку-лезным антигеном — метаноловым экстрактом микробной массы М.paraluberculosis); реакция неспецифична. Помимо названных ме­тодов диагностики паратуберкулеза, широко используют аллерги­ческую диагностику в соответствии с действующей инструкцией.

Биопрепараты. Вакцина БЦЖ (BCG): представляет собой живую лиофильно высушенную культуру вакцинного штамма тубер­кулезных микобактерий бычьего типа. Вакцинный штамм BCG (Bacillus Calmette — Guerin) был получен в 1924 г. французскими уче­ными Кальметтом и Гереном путем длительного культивирования (в течение 18 лет) вирулентного штамма М. bovis на картофельно-гли-цериновой среде с добавлением бычьей желчи. Для приготовления противотуберкулезной вакцины штамм БЦЖ выращивают на специ­альных средах в течение 20 сут. В ветеринарной практике вакцину БЦЖ используют в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах для профилактики туберкулеза у крупного рогатого скота.

Сухой очищенный туберкулин ППД для млекопитающих гото­вят из культуры микобактерий, которую выращивают в течение двух месяцев, а затем стерилизуют авто планированием. Белок из культуральной жидкости осаждают трихлоруксусной кислотой. Преципитат белка, отделенный центрифугированием, растворяют в воде и вновь осаждают сульфатом аммония. Белок — это основ­ная фракция туберкулина ППД, содержание его составляет 73,4...90 %. Кроме того, в состав препарата входят полисахариды, липиды и нуклеиновые кислоты.

Альттуберкулин (АТК)для млекопитающих: стерильный филь­трат культуры микобактерий, выращенных в течение двух месяцев на мясогидролизатном картофельно-глицериновом бульоне. Буль­он концентрируют, выпаривая до 1/10 первоначального объема, и затем добавляют 20 % экстракта бактериальной массы микобакте­рий.

Туберкулин ППД для птиц: готовят, используя пять штаммов М. avium. Выделение белка из культуральной жидкости и приго­товление препарата проводят, как при получении АТК.

Тема 23. ВОЗБУДИТЕЛЬ АКТИНОМИКОЗА