Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 25 )

Инкубация средой Игла: концентрацию лимфоцитов доводят до 3 ■ 106/мл. Готовят суспензию эритроцитов барана: эритроциты отмывают 0,15 М раствором хлорида натрия (три раза), затем из них готовят 0,5%-ю суспензию в среде Игла. Далее смешивают по 0,5 мл суспензии лимфоцитов и эритроцитов, смесь центрифуги­руют при 200 мин"1 в течение 5 мин и оставляют при 4 °С на 18 ч.

Учет реакции: осторожно покачивая пробирку, ресуспендиру-ют осадок (не перемешивая), каплю суспензии вносят в счетную камеру и исследуют методом фазою-контрастной микроскопии. Просматривают не менее 200 лимфоцитов и подсчитывают те клетки, к поверхности которых прикреплено более трех эритро­цитов — естественные розеткообразующие клетки (Е—РОК).

Технология выращивания животных отражается на их физио­логическом состоянии и на количестве Т - и В-клеток в частно­сти.

Выявление Т-хелперов и Т-супрессоров. Т-хелперы и Т-супрессоры несут на своей поверхности специфи­ческие антигены, которые можно обнаружить при помощи мыши­ных моноклональных антител в реакции непрямой иммунофлуо-ресценции. Лимфоциты, связавшие моноклональные антитела, светятся по периферии клеток, что позволяет определить их коли­чество при микроскопическом исследовании.

Методы оценки В-системы иммунитета (гуморальный иммуни­тет/ Включают в себя оценку В-лимфоцитов (общее содержание в крови, анализ антигенных детерминант) и вырабатываемых ими антител.

Количественное определение иммуно­глобулинов разных классов методом радиальной иммунодиффузии (по Манчини). Количество и соотношение им­муноглобулинов отдельных классов в биологических жидкостях отражают состояние В-системы. Иммунную сыворотку против ан­тител определенного класса (IgG, IgM, IgA) вносят в расплавлен­ный агаровый гель. После застывания агара антитела в нем равно­мерно распределены. Внесенный в лунку исследуемый материал (антиген) радиально диффундирует в толщу геля. Поскольку кон­центрация антител везде одинакова, то в результате реакции анти­ген — антитело в зоне эквивалентности образуются не полосы преципитации, а кольцо преципитации вокруг лунки с антигеном. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концент­рации антигена в исследуемой жидкости.

В предварительных опытах определяют оптимальное (рабочее разведение) антисывороток к иммуноглобулинам каждого класса. В каждом опыте устанавливают количество иммуноглобулинов в стандартной сыворотке и по отношению к ней определяют коли­чество иммуноглобулинов в исследуемом материале.

Используют 3%-й агар Дифко на веронал-мединаловом буфере с рН 7,3...7,4 (мединал — 35,4г, веронал — 5,25 г, дистиллирован­ная вода —до 1000 мл). В бактериологической пробирке смешива­ют по 5 мл расплавленного агара и антисыворотки. Берут два стек­ла размером 9 х 12 см, на одно из них помещают П-образную рам­ку, сверху кладут второе стекло. Толщина рамки составляет 1 мм. В щель между стеклами заливают смесь агара и антисыворотки, оставляют в вертикальном положении для застывания агара на 15...20 мин. Затем удаляют одно из стекол и рамку.

В агаре пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм (5 рядов по 7 лунок в каждом). В лунки первого ряда вносят разведения стандартной сыворотки, в остальные — исследуемые пробы по 1 мкл. Пластинку выдерживают во влажной камере 24 ч (igG, IgA) или 48 ч (IgM).

Строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают значения диаметров колец преципитации разведенной стандарт­ной сыворотки, на оси ординат —значения концентраций имму­ноглобулинов ( % или мг/мл). Измеряют диаметр колец преципи­тации в пробах и по калибровочной кривой устанавливают кон­центрацию соответствующего иммуноглобулина.

Все методы определения В-лимфоцитов в крови основаны на вы­явлении на поверхности В-лимфоцита структур, специфических только для В-клеток: рецепторы к (^-фрагменту иммуноглобули­нов, рецепторы к Сз-фракции комплемента, иммуноглобулиновые рецепторы, а также специфические В-антигены.

Метод розеткообразования (ЕАС—РОК). Эрит­роциты барана обрабатывают антителами гемолизина, затем ком­плементом. Образуется комплекс АГ—AT—С, содержащий компо­нент комплемента С3-фракции. Далее смешивают лимфоциты жи­вотного и обработанные эритроциты барана. Эритроциты за счет присутствующих на их поверхности молекул С3 избирательно сор­бируются на В-лимфоцитах, образуя «розетки».

Другие методы основаны на выявлении рецепторов к Рс-фрагментам иммуноглобулинов и иммуноглобулиновых детер­минант на поверхности В-клеток. Рецептор к Рс-фрагменту имму­ноглобулинов способен связывать агрегированный у-глобулин, меченный флуорохромом, что можно в последующем установить при помощи флуоресцентного анализа.

Используют меченные флуорохромом антиглобулиновые сыво­ротки или антисыворотки против иммуноглобулинов отдельных классов, например моноклональные антитела.

Серологические методы исследования.

В основе всех серологических исследований лежит специфическая реакция между антигенами и антителами.

Антигены — генетически чужеродные вещества, которые при па-рэнтеральном введении в организм животного вызывают ответную ре­акцию в виде сенсибилизации, толерантности и продуцирования ан­тител, взаимодействующих специфически с антителами как in vivo, так и in vitro. Различают антигены корпускулярные, клеточные (бакте­рии, эритроциты) и растворимые (молекулярно-дисперсные). Антиге­ны поливалентны— имеют несколько детерминантных рецепторов для связи с антителами, способны вступать в реакцию с антителами как в организме животного (in vivo), так и вне организма — в пробирке (in vitro). Антигенной функцией обладают не только полноценные ан­тигены, но и неполноценные (гаптены), то есть вещества небелковой природы (полисахариды, липидо-полисахаридный комплекс сомати­ческого антигена микробной клетки и другие вещества).

Антитела — высокомолекулярные специфические белки глобу-линовой фракции сыворотки крови (иммуноглобулины).

По проявлению феномена взаимодействия между антигеном и антителом in vitro различают осадочные реакции, лизирующие и нейтрализующие. Антитела, участвующие в осадочных реакциях, получили названия по типу взаимодействия с антигеном: агглюти­нины — вызывают склеивание корпускулярного антигена и осаж­дение комплекса антиген—антитело (агглютината) и преципити-ны — образуют преципитат с растворимым антигеном. В реакциях лизиса участвуют бактериолизины и гемолизины, обусловливаю­щие лизис, распад корпускулярного антигена. Нейтрализующие антитела обезвреживают, нейтрализуют токсическое действие ан­тигена.

В серологических реакциях, применяемых для диагностичес­ких целей, один из компонентов должен быть известен, по кото­рому ввиду специфичности определяют наличие другого компо­нента. Например, если взять заведомо известный антиген (сапной, бруцеллезный, сальмонеллезный) и с ним исследовать сыворотки крови от животных, то положительный результат реакции с дан­ным антигеном указывает на наличие в сыворотке соответствую­щих антител — то есть сыворотка получена от больного животно­го. И, наоборот, при наличии специфической сыворотки (гиперим­мунная сибиреязвенная, колибактериозная и др.) определяют ви­довую принадлежность (идентифицируют) возбудителя болезни, выделенного из исследуемого материала.

Серологические реакции ставят на физиологическом растворе потому, что реакция между антигенами и антителами происходит в слабоэлектролитной среде.

Реакция агглютинации (РА).

Сущность РА заключается в том, что при добавлении сыворотки крови, содержащей специфичес­кие антигену антитела, в равномерной взвеси клеток происходит их склеивание, образование глыбок, комочков, хлопьев, которые постепенно оседают на дно пробирки, формируя характерный осадок — агглютинат; жидкость над ним просветляется. Характер агглютината зависит от антигенного строения микробной клетки (антигена). Если антигеном является взвесь неподвижных бакте­рий (без жгутиков), имеющих только соматический О-антиген, образуется мелкозернистый осадок в течение 16...22 ч. Если анти­геном служит взвесь бактерий, имеющих жгутики (подвижные виды), и в агглютинации участвует наряду с соматическим еще жгутиковый Н-антиген, формируется крупнохлопчатый, крупно­зернистый агглютинат.

В ветеринарной практике РА используют для диагностики бру­целлеза, сальмонеллезов, колибактериоза, листериоза, вибриоза, лептоспирозов и других заболеваний. Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (пластинча­тый), кровяно-капельный, гемагглютинации, торможения гемагглю-тинации, антиглобулиновый Кумбса, РА по Кастеллани (метод ад­сорбции агглютининов), кольцевая проба (реакция) с молоком.

Для определения антител (по известному антигену) берут 5... 10 мл крови из яремной вены животного (у свиней из хвостовой) в стерильные пробирки и помещают их в теплое место. Пос­ле образования сгустка осторожно (стерильно!) отделяют его от стенок пробирки, обводя металлической проволокой (вязальной спицей), и ставят в холодное место для ретракции (отделения) сгустка. Сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, нумеру­ют их, с нарочным и сопроводительным письмом отсылают в ла­бораторию.

Сыворотки для РА (как и вообще при серологических исследо­ваниях) используют свежие без гемолиза или консервированные фенолом, мертиолатом натрия или борной кислотой. Антиген для РА представляет собой взвесь в физиологическом растворе убитых или живых бактерий. Для диагностических целей рекомендуется стандартный антиген биофабричного производства.

Для идентифицикации бактериальной культуры, выделенной из патологического материала, применяют стандартные сыворот­ки, а антиген готовят из суточной культуры — смыва с МПА. Спе­цифические стандартные агглютинирующие сыворотки получают на биофабриках путем гипериммунизации животных соответству­ющим антигеном (специально подготовленной взвесью живых или убитых микробов, эритроцитами и др.). Готовую сыворотку консервируют, разливают в ампулы и запаивают. Нередко диагно­стические сыворотки подвергают лиофильному высушиванию. Перед употреблением такие сыворотки разводят дистиллирован­ной водой. Но для постановки реакции (и промывания пипеток) ее разводят физиологическим раствором.

Постановка РА классическим (проби­рочным) методом. Исследуемые сыворотки разводят в чистых сухих пробирках с ровным сферическим дном. Для каждой сыворотки берут отдельную пипетку. В зависимости от инфекции производят соответствующие степени разведения сывороток (со­гласно инструкции). Например, для диагностики бруцеллеза сы­воротки разводят 1: 25; 1: 50; 1:100; 1 : 200; 1: 400.