Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 32 )

Смесь клеток культивируют в среде, содержащей ГАТ (гипок-сантин — аминоптерин — тимидин), что приводит к гибели лим­фоцитов и миеломных клеток, так как на этой среде растут только гибридомы.

Гибридомные клетки рассевают (клонируют) таким образом, чтобы в лунке панели для микрокультивирования оказалась толь­ко одна клетка, дающая начало клону. После размножения клеток оценивают их способность синтезировать нужные антитела (про­водят скрининг). Клонирование повторяют. В конечном итоге вы­бирают стабильный клон, продуцирующий антитела заданной специфичности.

Клетки гибридомы можно длительно хранить в замороженном состоянии (в жидком азоте).

Моноклональные антитела выделяют либо из культуральной жидкости (клетки гибридомы выращивают in vitro), либо из асци-тической (выращивание in vivo).

Моноклональные антитела используют для диагностики ин­фекционных болезней в иммуноферментном, радиоиммунном и иммунофлуоресцентном анализах.

Диагностические антигены. Предназначены для постановки раз­личных серологических реакций с целью серодиагностики инфек­ционных болезней животных. В зависимости от типа серологичес­кой реакции антигены могут быть корпускулярными (РА, РСК), на носителях (эритроцитарные антигенные диагностикумы для РИГА), растворимые (РП, РДП). Технология приготовления ан­тигенов разнообразна, но основой для антигенов любого типа слу­жат исходные селекционированные, без признаков диссоциации культуры микроорганизмов.

Контроль диагностических антигенов проводят по определен­ным параметрам:

контроль стерильности (см. вакцины);

антиген для серологических реакций должен быть определен­ной оптимальной концентрации, выраженной, например, числом микробных клеток в I мл;

активность антигена определяют в той или иной серологичес­кой реакции с заведомо положительной сывороткой. Антиген дол­жен давать четкую положительную реакцию. В некоторых случаях сначала устанавливают предельный титр антигена — разведение, в котором он дает положительную реакцию с наибольшим разведе­нием стандартной положительной сыворотки. Для постановки се­рологической реакции при диагностических исследованиях ис­пользуют рабочий титр антигена—двойную дозу предельного титра (единый бруцеллезный антиген);

специфичность антигена испытывают в серологической реак­ции с заведомо отрицательной сывороткой.

Корпускулярные антигены для серологических реакций оса­дочного типа контролируют на спонтанную агглютинацию — вы­падение в осадок в отсутствие антител.

Пример. Контроль диагностического бруцеллезного анти­гена для кольцевой реакции с молоком. Используют клетки бру-целл стандартной концентрации, окрашенные гематоксилином.

Контроль стерильности (см. контроль вакцин). Контроль специ­фичности и активности. Берут 10 проб свежего молока от здоро­вых коров. Молоко каждой пробы исследуют с разными количе­ствами положительной бруцеллезной сыворотки. Антиген призна­ют специфичным, если во всех пробирках, в которые не добавляли положительную сыворотку, получен отрицательный результат — молоко окрашено, заметно белое кольцо отстоявшихся сливок.

Антиген признают активным, когда во всех трех пробирках каж­дой пробы с позитивной сывороткой или в пробирках с 0,15 и 0,1 мл сыворотки получен четкий положительный результат —мо­локо белое, слой сливок синего цвета.

Диагностические аллергены. Данные биопрепараты (бруцеллин, туберкулин, маллеин) представляют собой экстракты из клеток возбудителя и содержат продукты их метаболизма. Аллергическая диагностика основана на выявлении гиперчувствительности за­медленного типа, которая развивается при ряде инфекционных болезней, особенно хронических. В основе этих диагностических тестов лежит специфическая реакция иммунного воспаления с участием сенсибилизированных Т-лимфоцитов.

Пример. Контроль диагностических аллергенов бруцелли-на, предназначенного для диагностики бруцеллеза,

Контроль стерильности {см. контроль вакцин).

Контроль безвредности: бруцеллин в объеме 0,5 мл вводят в об­ласть спины белым мышам массой 18...25 г. В течение Юсут мыши должны остаться живыми: воспалительная реакция на мес­те инъекции отсутствует.

Контроль специфичности: белым морским свинкам в депилиро-ванный участок боковой поверхности туловища внутрикожно вво­дят бруцеллин в объеме 0,1 мл и сравнивают с эталонным препа­ратом. При учете результатов через 24 и 48 ч на месте инъекции не должно быть аллергической реакции. Кроме того, здоровым 10 ов­цам бруцеллин вводят под кожу нижнего века по 0,5 мл (пальпеб-рально) и внутрикожно в подхвостовую складку по 0,2 мл. Конт­ролем также служит эталонный аллерген. Аллерген считают спе­цифичным, если у здоровых животных аллергических реакций не возникает. Кроме того, проверяют аллерген на антигенные свой­ства. Для этого у овец через 10...15сут после введения аллергена исследуют в РА и РСК сыворотку крови — антител не должно быть.

Контроль активности; 10...15 белым морским свинкам вводят подкожно (0,25...1)109 клеток штамма В. melitensis Rev 1 для аллер­гической сенсибилизации. Через 4нед в депилированный участок кожи вводят 0,1 мл исследуемого бруцеллина и в качестве контро­ля эталонный аллерген. Реакцию учитывают через 24 ч, измеряя диаметр эритем (отека).

Интенсивность реакции на исследуемый и эталонный аллерге­ны должна быть одинаковой.

ВОЗБУДИТЕЛИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Тема 13. СТАФИЛОКОККИ И СТРЕПТОКОККИ

Стафилококки (Staphylococcus). Принадлежат к порядку Eubacteriales, семейству Micrococcaceae. По современной класси­фикации их разделяют по патогенное™ на три вида: 1) S. aureus — независимо от образуемого пигмента — патогенные; 2) S. epider-midis — условно-патогенные, постоянные обитатели кожи и сли­зистых; 3) S. saprophyticus — непатогенные стафилококки. Среди всех видов этого рода существуют штаммы, которые вызывают у животных различные нагноительные процессы — фурункулы, кар­бункулы, флегмоны, панариции, гнойное воспаление ран, абсцес­сы, сепсис, септикопиемию (см. цв. рис. VIII). Широко распрост­ранен стафилококковый мастит у коров. Патогенные штаммы ста­филококков, попадая в желудочно-кишечный тракт человека, вы­зывают пищевую токсикоинфекцию. Сапрофитные стафилококки, обладающие гнилостными свойствами, обусловли­вают порчу сырья и пищевых продуктов.

Материал для микробиологического ис­следования. В лабораторию посылают асептически взятый гной, содержимое ран, язв, карбункулов, при подозрении на сеп­сис—кровь. Исследуют пробы комбикорма, а при мастите — па-ренхимное молоко.

Стафилококки — шаровидные грамположительные микроор­ганизмы, располагающиеся скоплениями в виде кучек или виног­радных гроздьев. Неподвижны. Споры и капсулы не образуют. Хорошо окрашиваются всеми анилиновыми красителями. Грам-положительная способность окраски может утрачиваться под воз­действием антибиотиков, сульфамидных препаратов и других факторов. Обнаружение стафилококков в мазке из крови, гноя, раневого содержимого дает основание для постановки диагноза на стафилококковую инфекцию. В других случаях результат микро-скопирования является ориентировочным.

Культурально-биохимические свойства. Стафилококки — аэробы, факультативные анаэробы. Хорошо рас­тут на обычных питательных средах при рН 7,2...7,8. Подщелачи-вание среды до рН 8,0...8,6 заметного влияния на рост микроба не оказывает, при понижении рН рост замедляется, а при рН 5,6...5,8 — прекращается. Среди неспорообразующих микробов стафилококки наиболее устойчивы к различным физическим и химическим воздействиям, что дает возможность использовать их как тест-микробов (объектов) при изучении эффективности де­зинфицирующих веществ. Стафилококки галлофилы растут на среде с концентрацией хлорида натрия до 8...10%. В МПБ они образуют обильное помутнение и слизистый осадок, на МПА — крупные круглые с ровными краями и умеренно выпуклой глян­цевой поверхностью колонии. На плотной среде стафилококки выделяют нерастворимые в воде липохромные пигменты — белый, лимонно-желтый и золотистый. Пигментообразование лучше протекает при рассеянном свете и обильной аэрации. Чистую культуру стафилококка можно получить после посева исследуемо­го материала на 5 %-й кровяной агар с последующей отвивкой ти­пичной колонии. В качестве селективной среды для выделения только стафилококков используют МПА, содержащий 8...10% хлорида натрия и 5 % дефибринированной крови. Некоторые штаммы при этом проявляют четкую зону гемолиза, но большин­ство из них обладает потенциальной гемолитической способнос­тью, что можно выявить, применив специальную методику.

Лизис эритроцитов может быть обусловлен разными типами гемотоксинов бактерий — а, Ь, с, D и др. Это экзотоксины, обла­дающие антигенными и иммуногенными свойствами. Экзотокси­нам стафилококков свойственно также летальное и некротизиру-ющее действие. Эндотоксины стафилококков обладают высокой термостабильностыо (при 100 "С выживают свыше 30 мин) и выра­женным энтеротоксическим действием. МПЖ и свернутую сыво­ротку они разжижают, молоко свертывают и пептонизируют. Фер­ментируют многие углеводы. Считают, что штаммы стафилокок­ка, сбраживающие маннит, являются патогенными. Однако мин-нитферментативная способность микроба (как и образование пигмента) нестабильна.

Для правильного представления об этиологической роли ста­филококков требуется выделить его из исследуемого материала и детально изучить несколько (иногда до 50) колоний, так как мно­гие патогенные штаммы не образуют золотистый пигмент и не вызывают гемолиз на кровяном агаре при обычных условиях. С этой целью чистые культуры стафилококков проверяют по их спо­собности ферментировать маннит, коагулировать цитрированную плазму, выделять фибринолизин и лецитиназу, ДНК-азу, обладать скрытой (потенциальной) гемолитической способностью. Для бо­лее полной характеристики патогенных штаммов определяют у них способность выделять дермонекротоксин, токсин общего дей­ствия и энтеротоксин.

Ферментацию маннита стафилококками определяют путем по­сева на МПБ, содержащий 0,5 % маннита, индикатор Андрэдэ и газовые поплавки. После 1...2-суточной инкубации при 37 "С сре­да с патогенным штаммом микроба краснеет; в газовых поплавках иногда скапливаются пузырьки газа. Это свойство хорошо выяв­ляется на полужидкой среде с теми же компонентами.