Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 47 )

Наряду с исследуемыми пробами материала ставят контроли антигена: 1) контроль антигена (проверка самоагглютинации) — в пробирку наливают 0,5 мл антигена в рабочем разведении и добав­ляют 0,5 мл 3%-го формалинизированного раствора хлорида на­трия; 2) контроль активности антигена; в каждую пробирку с раз­веденной агглютинирующей кампилобактериозной сывороткой первого типа добавляют по 0,5 мл антигена; 3) контроль специ­фичности антигена: в две пробирки, содержащие по 0,5 мл нор­мальной сыворотки в разведениях 1: 100 и 1: 200, добавляют по 0,5 мл антигена. Все пробирки встряхивают и далее поступают с ними так же, как с опытными.

Вначале учитывают результаты контроля антигена. Отрица­тельная реакция в 1-м и 3-м контролях при положительной во 2-м свидетельствует о правильности постановки реакции.

Учет результатов: 1) положительная —реакция хорошо выра­жена (на три-четыре креста) во всех пробирках или только в 1-й и 2-й; 2) сомнительная —агглютинация на один-два креста в 1-й и во 2-й пробирках; 3) отрицательная — отсутствие агглютинации во всех пробирках.

У больных овец для исследования берут сыворотку крови, разводят ее в 100, 200 и 400 раз. Результат считают положитель­ным, если исследуемая сыворотка дает реакцию агглютинации в разведении 1 : 200 и выше на четыре или три креста, сомнитель­ным — на четыре или три креста в разведении 1 : 100 либо на два или один крест в разведении 1 : 200, отрицательным — если агглютинация отсутствует или ее оценивают не выше чем на два или один крест в разведении 1 : 100. Сыворотку овец, вакцини­рованных против кампилобактериоза, серологически не иссле­дуют.

Кроме РА сыворотку животных можно исследовать в РСК, ре­акции иммунофлуоресценции или реакции иммунной сорбции антител, меченных ферментами. Для выявления антител в РНГА разработаны экспериментальные партии диагностикумов, кото­рые используют для диагностики кампилобактериозов животных и человека.

Биопрепараты. И нактивиро ванная эмульсированная вакцина против кампилобактериоза овец.

Кампилобактериозные агглютинирующие сыворотки.

Кампилобактериозный антиген представляет собой инактиви-рованную 0,3%-м раствором формалина суспензию кампилобак-терий.

Возбудитель лептоспироза. Принадлежит к порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaceae, роду Leptospira. Патоген­ные лептоспиры составляют 25 серологических групп, включающих 124 серологических варианта, из них от сельскохозяйственных жи­вотных выделено семь— L. icterohaemotrfmgiae, L.pomona, L. tarassowi, L grippotyphosa, L. hebdomadis, L canicola, L. cazackstanika.

Лептоспироз — инфекционная болезнь разных видов животных и человека. Наиболее часто болезнь протекает с кратковременной лихорадкой в острой и подострой форме; гемоглобинурией {осо­бенно у телят), желтушностью слизистых оболочек. У коров и сви­номаток возможны аборты. Переболевшие животные длительное время остаются лептоспироносителями.

Бактериологическое исследование. В лабо­раторию направляют при жизни животного мочу, кровь в период лихорадки; посмертно — труп или кусочки паренхиматозных ор­ганов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей, пери-кардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, абортиро­ванный плод или органы плода. Жидкие субстраты отсасывают в стерильные пробирки. Патологический материал доставляют с на­рочным в опечатанном ящике не позднее 6 ч после гибели живот­ного в летнее время и 12 ч зимой. Воду (до 2 л) на наличие лептос-пир направляют в лабораторию в бутылях (колбах).

Из патологического материала готовят нативные неокрашен­ные препараты для микроскопирования методом «раздавленной капли» в темном поле зрения. Лептоспиры плохо воспринимают анилиновые краски. По Граму окрашиваются отрицательно, по методу Романовского — Гимза через 48 ч — в розово-фиолетовый цвет, по методу Киктенко — в красно-фиолетовый цвет (на бес­цветном фоне). Метод Киктенко заключается в том, что на не­фиксированный препарат наносят специальный раствор (0,2 г та­нина, 2 мл формалина, 5 мл 4 %-го спиртового раствора йода, 100 мл дистиллированной воды). Выдерживают 1 мин, сливают и наносят другой красиг генциан виол ета в 100 мл 25%-го этилового спирта) на 50 с при подогревании. После этого препа­рат промывают, высушивают и микроскоп и руют под иммерсией.

Морфология. Лептоспиры представляют собой тонкие длинные спиралеподобные микроорганизмы длиной 10... 15 мкм и шириной 0,1—0,2 мкм, количество спиралей (завитков) 10... 12 и более. Споры и капсулы не образуют. На концах лептоспир име­ются утолщения. Движение маятникообразное. Подвижность со­храняется не более 2 ч с момента взятия крови или мочи.

Выделение чистой культуры. Производят посе­вы патологического материала на полусинтетическую среду ГНКИ, состоящую из овечьего альбумина, воды и компалона (фактора роста), или на среды Любашенко и Терских, в основу которых взят фосфатно-буферный раствор на 5 % кроличьей сы­воротки и 1 % пептона, дистиллированная вода; рН среды 7,2...7,4. Лептоспиры — факультативные аэробы. Оптимальная температура роста культивирования 28...30 "С. Культивирование составляет 7...20сут. Среда остается прозрачной, рост культуры определяют микроскопированием препаратов из нее. Если макроскопически виден рост (помутнение среды и осадок) — культура загрязнена.

Патогенность. Определяют биопробой: выделенной культурой заражают морских свинок или золотистых хомяков, крольчат 3...5-недельного возраста. Культуру или взвесь исследуе­мого растертого материала инъецируют подкожно или внутрибрю-шинно хомякам в дозе до 1 мл, крольчатам — 2...3 мл (по два жи­вотных на каждую пробу). Одного убивают через 4...5 сут, второ­го—спустя 14...1бсут, вскрывают и проводят бактериологическое исследование.

Лептоспиры продуцируют ферменты (плазмокоагулазу, липазу и лецитиназу) и экзотоксины (гемотоксин, некротоксин), а также эндотоксин.

В культуре ткани лептоспиры проявляют цитопатогенное дей­ствие.

Серологические методы. Чаще используют для прижизненной диагностики лептоспироза. Кровь от животных допускается исследовать лишь через два месяца после их вакцина­ции. Самым распространенным методом является реакция микро-агглютинации (РМА) со свежей, высушенной на фильтровальной бумаге или консервированной 0,5 %-м раствором фенола сыво­роткой. Сначала готовят разведения сыворотки — 1: 50, 1:100, 1 : 200, 1: 400 (при необходимости и больше), затем добавляют ан­тиген — живые культуры лептоспир.

Удобно ставить реакцию в следующей модификации: из каж­дого разведения сыворотки (начиная с большего) по 0,1 мл вно­сят в 6...13 лунок пластины для серологических реакций или в пробирки Флоринского в зависимости от количества имеющихся в лаборатории антигенов — живых культур диагностических штаммов лептоспир. Каждый антиген — 5,..15-суточная культура лептоспир с концентрацией 70...100 микробных тел в поле зре­ния микроскопа (предварительная проверка) — вносят по 0,1 мл в четыре лунки (пробирки) с разными разведениями сыворотки по 0,1 мл. Электролитной средой служит 0,85 %-й раствор хлори­да натрия. Антигены с сывороткой встряхивают, помещают в термостат на 1 ч при 30 °С. Контрол — культура лептоспир с фи­зиологическим раствором (также по 0,1 мл). Используют иммунно-ферментный анализ.

Для учета реакции используют микроскопию: из каждой про­бирки (или лунки) готовят препарат «раздавленная капля» и мик-роскопируют его в темном поле микроскопа при увеличении 20 х 10. При наличии гомологичных антигену антител в сыворотке происходит агглютинация— образуются агглютинаты склеенных лептоспир в виде паучков или пучков, сохраняющих подвижность на свободных концах. Результат РМА оценивают в крестах: «++++» — агглютинация 100 % лептоспир, «+++» — 75 %, «++» — 50%, «+» — 25 % лептоспор; «—» — агглютинация отсутствует. В небольших разведениях сыворотки наблюдают набухание и непод­вижность, зернистость и лизис лептоспир. Положительная реак­ция признается с оценкой в четыре и три креста, два креста — ре­зультат сомнительный.

Помимо РМА ставят обычные РА, РСК и РИФ по общеприня­тым методикам.

Биопрепараты. Депонированная поливалентная вакци­на против лептоспироза сельскохозяйственных и промысловых животных: готовят из 7...10-суточной культуры лептоспир, кон­сервированных 5%-м раствором карболовой кислоты.

Поливалентная вакцина против лептоспироза сельскохозяй­ственных и промысловых животных: получают методом гиперим­мунизации волов-продуцентов. Антигены для гипериммунизации готовят из производственных штаммов 6 серогрупп.

Антигены для диагностики лептоспироза в реакции макроагг­лютинации: готовят из эталонных штаммов лептоспир. Выращен­ные культуры инактивируют формалином, концентрируют, рас­фасовывают по ампулам и подвергают сублимационному высуши­ванию.

Групповые агглютинирующие лептоспирозные сыворотки предназначены для определения серогрупповой принадлежности лептоспир, выделенных из патологического материала, а также лептоспир, используемых в качестве антигенов в реакции микро­агглютинации при серологической диагностике лептоспироза.

Возбудитель дизентерии свиней (Serpulina hyodysenteriae). При­надлежит к роду Serpulina.

Бактериологическое исследование. Включа­ет в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии, а также выделение чистой культуры посе­вом на питательные среды и идентификацию возбудителя по куль-турально-морфологическим и ферментативным свойствам.

Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют фекалии, для посмертной — слизистую оболочку большой ободоч­ной кишки, которую соскабливают после удаления из кишечника содержимого и промывания водой. От трупов материал берут не позднее чем через 2 ч после гибели животного: материал должен быть исследован в течение 2...4 ч, а при хранении на холоде — 6...8ч.

Микроскопия. Поскольку культивирование возбудителя весьма трудоемко, микроскопическое исследование — это основ­ной метод диагностики, доступный практическим лабораториям. Поступивший материал исследуют методом темнопольной, фазо-во-контрастной или обычной световой микроскопии.