Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 15 )

Чтобы обнаружить образование газа, в среду опускают поплав­ки (трубочки диаметром 5...7 мм и длиной 35...45 мм, запаянные с одного конца) запаянным концом вверх. Как правило, готовят ос­новной фон среды, добавляют к нему индикатор; при необходи­мости доводят рН среды до 6,8 и разливают в пробирки с поплав­ками (по 9 мл в каждую); стерилизуют при 98,06 кПа.

Углеводы и спирты следует стерилизовать отдельно в виде 10%-х водных растворов и Добавлять после стерилизации к стерильному фону среды. Растворы дисахаридов лучше стерилизовать фильтро­ванием, чтобы избежать их гидролиза при высокой температуре. Во все среды с углеводами и спиртами одновременно вносят по 0,1...02 мл суспензии клеток изучаемого микроорганизма и ставят в термостат.

Если изучаемый организм развивается быстро, то результаты можно учитывать через 48...96 ч, а если медленно — через 7...10сут. Визуально по помутнению среды, образованию пленки, осадка отмечают рост или его отсутствие во всех использованных средах. По изменению цвета индикатора делают заключение о том, чем сопровождается использование субстратов — подкисле-нием или подщелачиванием среды, или рН среды не изменяется (цв. рис. IV). О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке. Результаты сравнивают с контрольной средой, т. е. с фоном, не содержащим ни углеводов, ни спиртов. Все данные на­блюдения вносят в таблицу. На основании полученных результа­тов делают заключение о том, какие углеводы и спирты использу­ет изучаемый микроорганизм и сопровождается ли этот процесс накоплением кислоты или образованием газа.

Аэробное окисление или сбраживание-углеводов. Это различие в метаболизме углеводов использу­ют при характеристике многих представителей гетеротрофных микроорганизмов. Среду (состав: пептон — 0,2 г, NaCl — 0,5 г, КНРО4 — 0,03 г, вода дистиллированная — 100 мл, агар-агар — О,3г, бромтимолблау — 0,3мл 1%-го водного раствора; рН 7,1) разливают в пробирки.

Углеводы готовят в виде 10%-х растворов, стерилизуют отдельно и вносят в среду после стерилизации так, чтобы их конечная кон­центрация соответствовала 1 %. Для каждого углевода используют две пробирки. После посева поверхность среды в одной пробирке заливают стерильным парафином или смесью вазелинового масла и парафина (1 : 1). Продолжительность культивирования составляет 8...10сут. Образование кислоты регистрируют по изменению цвета индикатора. Организмы, осуществляющие брожение, развиваются и подкисляют среду в двух пробирках, тогда как организмы, осуще­ствляющие аэробное окисление, — только в одной.

Гидролиз крахмала. Микроорганизмы, образующие амилазу, используют продукты гидролиза крахмала как источник углерода и энергии. Для выявления этой способности используют среду следующего состава (%): пептон—1,0, КНРО4 —0,5, ра­створимый крахмал —0,2, агар-агар—1,5; рН среды —6,8...7,0. Готовят 40 мл указанной среды, стерилизуют и разливают в две стерильные чашки Петри. Когда среда застынет, клетки изучаемо­го организма высевают штрихом по диаметру чашки. Продолжи­тельность культивирования 7...10 сут.

Гидролиз крахмала обнаруживают по зоне просветления среды вдоль штриха. Особенно четко она видна после обработки агаро­вой пластинки раствором Люголя. Так как йод — индикатор крах­мала, то вся среда окрашивается в синий цвет, за исключением зоны гидролиза крахмала, которая остается бесцветной или может приобрести красно-бурую окраску, если крахмал гидролизуется в основном до декстрина.

Разжижение желатины. Разжижать желатину спо­собны микроорганизмы, выделяющие в среду протеолитические ферменты (коллагеназы). Для выявления этой способности иссле­дуемый микроорганизм высевают на мясопептонную желатину (МПЖ), приготовленную следующим образом: к МПБ добавляют 10...15 % желатины и оставляют на 20...30 мин, чтобы желатина на­бухла, затем смесь нагревают на водяной бане до полного растворе­ния желатины и разливают в пробирки по 8...10 мл. Стерилизуют при 4,8 Па 15 мин. Посев осуществляют уколом. Продолжитель­ность культивирования 7... 10 сут при комнатной температуре. ■ Разжижение желатины или его отсутствие отмечают визуально. Если желатина разжижается, указывают интенсивность и форму разжижения. Разжижение бывает послойным, воронкообразным, мешковидным, пузырчатым {рис. 37).

Образование аммиака. Свойственно микроорганиз­мам, дезаминирующим аминокислоты. Эту способность микроор­ганизмов выявляют при их росте в -

Рис. 37. Типы разжнження желатины

МПБ. Для этого МПБ разливают в пробирки по 8...10мл в каждую, стерилизуют при 9,8 Па и засевают клетками изучаемого микроорганизма. Образование ам­миака обнаруживают по изменению окраски лакмусовой бумаги. Для этого после посева помещают в пробирку над средой стериль­ную полоску красного лакмуса, зажимая ее между пробкой и гор­лышком пробирки. Чтобы затруднить улетучивание аммиака, пробку пробирки заворачивают в целлофан.

При образовании аммиака полоска красного лакмуса синеет. Лакмусовые бумажки стерилизуют в чашке Петри автоклавирова-нием при 4,9 Па.

Образование индола. Многие микроорганизмы в процессе развития образуют из триптофана индол, что обусловле­но их триптофаназной активностью и служит важным диагности­ческим признаком. Индол обнаруживают по качественной реак­ции с реактивом Эрлиха. МПБ с 0,01 % триптофана разливают в пробирки по 8...10 мл, стерилизуют при 4,9 Па и засевают клетка­ми изучаемого организма.

Через 5...7 сут после посева проводят качественную реакцию на присутствие индола в культуре. Для этого на поверхность среды, не перемешивая, вносят 1 ...2 мл реактива Эрлиха: появление крас­ной окраски свидетельствует о наличии индола. Параллельно про­водят качественную реакцию на индол в стерильной среде.

Образование сероводорода (H2S). Свойственно микроорганизмам, использующим в процессах метаболизма серо­содержащие аминокислоты, например цистеин, цистин, метио-нин. Эту способность выявляют при выращивании микроорганиз­мов в МПБ, который разливают в пробирки по 8...10 мл в каждую, стерилизуют при 4,9 Па и засевают клетками изучаемого организ­ма. После посева над средой помещают полоску бумаги, пропи­танную раствором ацетата (уксуснокислого) свинца, зажав ее меж­ду пробкой и горлышком пробирки. Пробку пробирки заворачи­вают в целлофан, чтобы затруднить улетучивание сероводорода. Продолжительность культивирования 7...10 сут.

Выделение H2S. При развитии микроорганизмов H2S в МПБ обнаруживают по почернению бумаги вследствие образова­ния сульфида свинца.

При развитии микроорганизмов на среде с железоаммонийным цитратом о выделении сероводорода судят по почернению среды из-за образования сульфида железа (FeS). Образование сероводо­рода характерно и для микроорганизмов, осуществляющих про­цесс сульфатредукции.

Воздействие на молоко. Молоко содержит углево­ды (лактозу), белки (казеин), витамины, минеральные соли, по­этому многие микроорганизмы хорошо в нем растут. Рост микро­организмов в молоке может быть связан со сбраживанием лакто­зы, протеолизом казеина или с двумя этими процессами одновре­менно.

Для определения воздействия микроорганизмов на молоко поступают следующим образом. Молоко обезжиривают сепари­рованием или центрифугированием в течение 15 мин при 2...3тыс. мин"'. При центрифугировании жиры образуют на по­верхности молока достаточно плотную пленку. Обезжиренное мо­локо разводят водой (4 части молока на I часть воды), добавляют индикатор бромкрезолпурпур (2 мл 1,6%-го спиртового раствора на 1 л молока) или лакмус (10 мл 4%-го раствора на I л молока), разливают в пробирки по 8...10мл в каждую и стерилизуют при 4,9 Па.

Результаты учитывают спустя 6... 14 сут после посева. Исполь­зование лактозы с образованием кислот отмечают по изменению цвета индикатора. Если степень подкисления достаточно велика, наблюдается коагуляция казеина (образование сгустка, часто со­провождаемое отделением сыворотки). Образование диоксида углерода (углекислоты) микроорганизмами в процессе использо­вания лактозы хорошо видно по сгустку, который пронизан пу­зырьками.

Воздействие микроорганизмов на казеин молока тоже вызыва­ет коагуляцию, но она имеет место при нейтральной или слабоще­лочной реакции среды и является результатом образования мик­роорганизмами казеинолитических ферментов. При высокой ак­тивности этих ферментов отмечается «просветление» молока, на­зываемое пептонизацией, что связано с протеолизом казеина.

Отношение к кислороду. По отношению к кисло­роду различают четыре большие группы микроорганизмов: обли-гатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы (аэро­бы) и облигатные анаэробы.

Для описания микроорганизмов и дальнейшей идентификации ограничиваются наблюдением роста изучаемого организма после посева уколом в агаризованную среду или после посева в расплав­ленную агаризованную среду. Строгие аэробы растут на поверхно­сти среды и в самом верхнем ее слое, микроаэрофилы — на неко­тором расстоянии от поверхности среды, факультативные анаэро­бы развиваются по всей толще среды, облигатные анаэробы — только в глубине среды.

Чтобы определить принадлежность изучаемого микроорганиз­ма к одной из вышеуказанных групп, поступают следующим обра­зом. МПА (или другую, благоприятную для микроорганизма сре­ду) разливают в четыре пробирки на 1/2 ее высоты и стерилизуют при 30 Па. В две пробирки с МПА посев проводят уколом. В двух других пробирках МПА расплавляют в кипящей водяной бане и дают остыть до 48...50 X, а затем в среду вносят петлей исследуе­мый материал, тщательно перемешивают и дают агару застыть.

Отмечают рост и его интенсивность по уколу и в толще среды. В соответствии с этим характеризуют отношение исследуемого микроорганизма к кислороду.

Оксидазная активность. Этот тест используют обычно для дифференциации представителей семейства Pseudomonadaceae от других палочковидных бактерий, не окраши­вающихся по Граму. Для определения оксидазной активности на­носят несколько капель 1%-го водного раствора тетраметилфени-лендиамина на колонию в чашке Петри. Колонии организмов, об­ладающих оксидазной активностью, приобретают красную окрас­ку, которая через 10...30 мин переходит в черную.