Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 24 )

Для определения общего количества микроорганизмов в 1 г продукта делают посев 0,1 и 0,01 г пробы на питательный агар ме­тодом пластинчатых разводок Коха, инкубируют 48 ч и подсчиты­вают число колоний.

Для определения БГКП в 1 г продукта производят посев 5 мл взвеси на среду Кода (питательный бульон, сульфанол, лактоза и бромтимоловый синий), которая является элективно-дифферен­циальной средой для БГКП, и инкубируют 18...20 ч. При росте лактозоположительных БГКП первоначальный синий цвет изменяется на темно-зеленый или ярко-желтый. Специфические изме­нения на среде Кода не требуют дальнейшего подтверждения.

Для определения наличия сальмонелл берут навеску продукта массой не менее 25 г. Делают посев разведения навески в 100 мл среды обогащения (Мюллера, Кауфмана), инкубируют 24 ч. В по­ложительном случае выделяют и идентифицируют чистые культу­ры бактерий.

Бактерии рода Proteus выявляют по методу Шукевича. С этой целью 0,5 мл взвеси продукта вносят на скошенный питательный агар в конденсационную воду, инкубируют 24 ч. При наличии протея наблюдается ползучий рост. В мазках выявляют грамотри-цательные палочки, определяют подвижность и идентифицируют культуру бактерий.

Для определения коагулазоположительных стафилококков 0,2 мл взвеси продукта высевают на желточно-солевой агар, инку­бируют посевы при 37 °С и при комнатной температуре. При об­наружении стафилококков проводят их идентификацию.

Для обнаружения анаэробных спорообразующих бактерий рода Clostridium делают посев 10-кратных разведений взвеси в сульфитциклосериновую среду (СЦС) и Вильсона—Блера. Посе­вы инкубируют при 46 °С в течение 12 ч; при наличии клостри-дий наблюдается почернение среды. При положительном резуль­тате посева разведения 101 считается, что в 1 г продукта содер­жится 10 клеток соответствующих бактерий; разведения Ю3—100 клеток и т. д.

Колбасные изделия и продукты из мяса в соответствии с дей­ствующими нормативами не должны содержать БГКП (в 1 г про­дукта), сальмонелл (в 25 г), бактерий рода Proteus и сульфитреду-цирующих клостридий (в 0,1 г); микробное число не должно пре­вышать 103.

Тема 11. ИЗУЧЕНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА И СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Неспецифические реакции организма. Защи­ту макроорганизма от возбудителей инфекционных болезней обеспечивает не только иммунная система, но и неспецифические механизмы — непроницаемость слизистых и кожных покровов, фагоцитоз, бактерицидное действие лизоцима, а также гумораль­ные факторы — комплемент, пропердин и др.

Количественное определение лизоцима в сыворотке крови.

Лизо-цим — гидролитический фермент, расщепляющий высокомолеку­лярные полисахариды бактерий (пептидогликан), находится в тка­нях, секретах, экскретах (за исключением пота и мочи), действуя бактерицидно на многие бактерии. Присутствие и активность ли-

зоцима определяют по его способности вызывать лизис бактерии Micrococcus lysodeicticus.

Готовят 1%-й агаровый гель (Дифко) на 1/15 М фосфатно-со-левом буферном растворе (ФСБР). В расплавленный агар при тем­пературе 6О...7О°С вносят ацетоновый порошок биомассы М. lysodeicticus из расчета 10 мг на 100 мл геля. Компоненты переме­шивают и разливают в чашки Петри (толщина слоя 4 мм). В зас­тывшем агаре делают лунки диаметром 5 мм.

Параллельно определяют активность стандартного лизоцима, кристаллизованного из яичного белка. Для этого лизоцим разво­дят в 1/15 М ФСБР, чтобы получить разведения с концентрацией 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 40 и 70 мг/мл. Затем по 0,05 мл каждого разведе­ния лизоцима вносят в лунки. Чашки Петри выдерживают 48 ч во влажной камере при 37 "С и измеряют диаметр зоны лизиса М. lysodeicticus вокруг лунок.

Далее на основании полученных данных строят калибровочную кривую, откладывая на осях координат значения концентрации лизоцима и диаметра зоны лизиса. Сыворотку крови разводят в ФСБР в соотношении 1: 5, вносят по 0,03 мл в лунки и далее по­ступают, как при определении активности стандартного лизоци­ма. Измерив диаметр зоны лизиса, по калибровочной кривой вы­числяют содержание лизоцима в исследуемой пробе.

Количественное определение комплемента в сыворотке крови.

Комплемент (С) представляет собой сложную систему главным образом неактивных белков крови. Процесс их активации (по классическому пути) запускается образованием комплекса анти­ген—антитело (АГ—AT) и происходит в виде цепной реакции: комплекс Ar + AT + Ci+C4 + C2 + C3 + C5 + C6 + C7 + C8 + C9. В

процессе активации образуется литический комплекс, который делает мембрану клетки проницаемой; внутрь клетки осмотически поступает вода, в результате клетка набухает и лопается. Такое разрушение клеток (антигенов) под влиянием антител и компле­мента получило название иммунного лизиса. Наиболее эффективно комплемент действует на бактериальные клетки в сочетании с ли-зоцимом. Кроме того, бактериальные клетки (антигены) после взаимодействия с антителами и комплементом легче поглощаются фагоцитами.

Количество комплемента в крови (сыворотке крови) определя­ют в реакции иммунного лизиса с использованием эритроцитов барана и гемолизина в качестве антител к эритроцитам барана. Эритроциты барана, обработанные гомологичными антителами и чувствительные в таком состоянии к литическому действию комп­лемента, называют гемолитической системой. Количество компле­мента измеряют в 50%-х гемолитических единицах (СН50). За еди­ницу комплемента принимают такое его количество в объеме 0,5 мл, которое за 30 мин при 37 °С обусловливает лизис 50 % эритроцитов в 0,5 мл гемолитической системы (5%-я суспензия эритроцитов барана в веронал-мединаловом буферном растворе с рН 7,3...7,4+ гемолизин в тройном титре).

Исследуемую сыворотку в возрастающих дозах разливают по пробиркам (например, 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,08; 0,1мл), добавляют ФСБР до 0,5 мл и вносят во все пробирки по 0,5 мл стандартизированной гемсистемы. Одновременно ставят конт­роль на резистентность эритроцитов (0,5 мл ФСБР + 0,5 мл ге-мосистемы). Пробирки встряхивают и выдерживают 30 мин при 37 °С, охлаждают 10 мин при 2...4 X, центрифугируют 15...20 мин при оборотах 3000 мин"1. Насадочную жидкость колориметрируют и по коэффициенту экстинкции определяют процент гемолиза при помощи заранее построенной калибро­вочной кривой.

Калибровочную кривую строят следующим образом: к 1 мл 5%-й суспензии эритроцитов добавляют 3 мл дистиллированной воды, эритроциты при этом полностью лизируются (100%-й гемолиз). Из полученного лизата путем добавления буферного раствора го­товят пробы с 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90%-м гемоли­зом. На фотоэлектроколориметре определяют оптическую плот­ность каждой пробы (кювета шириной 1 мм, синий светофильтр), затем на оси абсцисс откладывают процент гемолиза, а на оси ор­динат—коэффициент экстинкции. СН50 вычисляют по дозе сы­воротки, дающей гемолиз, наиболее близкий к 50 %. Для этого ис­пользуют специальную формулу (Крога) или, что проще, коэффи­циенты, рассчитанные по этой формуле. Например, если исследу­емая сыворотка в разведении 1:25 дает 30%-й лизис, то СН5о в 1 мл составит 25 — 0,844 = 21,1 ед.

Демонстрация фагоцитоза бактерии.

К фагоцитирующим клет­кам относят полиморфноядерные лейкоциты крови. Поглощение микробной клетки фагоцитом может не сопровождаться гибелью микроорганизма (незавершенный фагоцитоз) или приводить к внутриклеточному перевариванию захваченных бактерий (завер­шенный фагоцитоз).

Белой мыши внутрибрюшинно вводят 2 мл стерильного МПБ, затем через 2...3 ч — 0,5 мл культуры эшерихий. Спустя 20...40 мин шприцем из брюшной полости отбирают экссудат, делают мазки на предметном стекле, фиксируют спирт-эфиром и окрашивают метиленовой синью (экспозиция 2...3 мин). При микроскопирова-нии можно наблюдать различные стадии фагоцитоза: поглощение, деструкцию (переваривание) клеток (цв. рис. VI).

Методы оценки активности фагоцитиру­ющих клеток. Для оценки активности фагоцитов использу­ют следующие показатели: фагоцитарный показатель — процент фагоцитирующих клеток от общего числа учтенных нейтрофиль-ных лейкоцитов; фагоцитарное число — среднее число микробных клеток, поглощенных одним лейкоцитом (характеризует интен­сивность фагоцитоза).

Определение фагоцитарного показателя. В чистую стерильную центрифужную пробирку вносят 0,2 мл 2%-го раствора цитрата натрия, 0,1 мл крови морской свинки или кролика и 0,05 мл суспензии убитых нагреванием бактерий S. epidermidis, Е. сок или других (концентрация 0,5 ■ 109 клеток по оптическому стандарту мутности). Компоненты перемешивают и выдерживают при 37...38°С в течение 30 мин, затем центрифугируют 15,..20мин при 2500...3000 мин"1 до разделения на прозрачный слой плазмы, слой эритроцитов и тонкий сероватый средний слой лейкоцитов. Осторожно отсасывают плазму, пипеткой берут средний слой, дела­ют 3...5 мазков и окрашивают по методу Романовского—Гимза. Пре­парат микроскопируют, подсчитывают не менее 100 нейтрофильных лейкоцитов и определяют среди них число (%) фагоцитирующих.

Методы оценки иммунного статуса макроорганизма.

Работа им­мунной системы, как и любой другой системы организма, может нарушаться, что неизбежно повысит восприимчивость животного к инфекционным заболеваниям.

Методы оценки Т-системы иммунитета (клеточный иммунитет). Из числа существующих методов оценки Т-иммунитета наиболее известны следующие.

Метод «спонтанных розеток» (Е—РОК). Т-лим-фоциты несут на своей поверхности рецепторы, реагирующие с мем­бранными структурами эритроцитов барана. После сорбции эритро­цитов Т-клетки приобретают форму «розетки», что позволяет выяв­лять их в популяции лимфоцитов. Реакцию проводят в 3 этапа.

Выделение лимфоцитов барана: в центрифужную пробирку на­ливают 2 мл разделяющего раствора, состоящего из 9%-го водного раствора фиколла и визотраста-370, доведенного до плотности 1,077 г/мл (соотношение 8 : 2). Затем на разделяющий раствор ос­торожно наслаивают 2...4 мл крови с гепарином (100 МЕ/мл), раз­веденной средой Игла в соотношении 1 : 2...1:4. Смесь центрифу­гируют при 600 мин~1 и температуре 20 °С. Лимфоциты, сконцент­рированные в виде беловатого слоя над разделяющим раствором, отсасывают пастеровской пипеткой и отмывают средой Игла (при 600 мин""1 — 10 мин два раза, 200 мин"1 — 10 мин один раз).