Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 11 )

Принцип действия у «ло-душечных» терморегуляторов основан на том, что плоская

Рнс. 31. Термостат:

контактный термометр; 2—дверцы термостата; 3— полки

латунная гофрированная коробочка с запаянной в ней жидкостью укрепляется таким образом со специальным устройством, что при нагревании выше заданной температуры жидкость в коробочке, расширяясь, оказывает давление на ее стенки и происходит от­ключение от сети. По мере охлаждения термостата жидкость в ко­робочке также охлаждается и не давит на ее стенки («подушеч­ки»), поэтому стержень с рычажком, к которому плотно подходит «подушечка», включаются в сеть обогревания.

В современных термостатах обычно применяют контактный терморегулятор — ртутный термометр с впаянными с двух сторон платиновыми проволоками. Один конец проволоки достигает ка­нала термометра, а другой заканчивается снаружи клеммой. Про­волоку с помощью наружного магнита располагают на различном уровне от столбика ртути в термометре, и температура автомати­чески поддерживается в термостате.

Для культивирования анаэробов и микроаэрофильных бакте­рий используют эксикатор и анаэростат.

Эксикатор представляет собой стеклянный сосуд с при­тертой крышкой. На его дно ставят часовое стекло или открытую чашку Петри с химическими веществами, которые активно связы­вают кислород воздуха [например, пирогаллол с гидроксидом (ед­ким натром)]. Сверху на специальный выступ эксикатора кладут фарфоровую подставку с отверстиями, а на нее пробирки или чашки с посевами и плотно закрывают крышку. Для герметичнос­ти края эксикатора смазывают вазелином; затем эксикатор поме­щают в термостат.

Анаэростат (рис. 32) — металлический герметически зак­рывающийся цилиндрический сосуд, снабженный кранами для удаления воздуха или подачи нужного для работы газа (СО2, Ni, О2 и др.) и вакуум-манометром. Посевы помещают внутрь цилин­дра, закрывают крышкой и с помощью насоса из анаэростата уда­ляют воздух. Степень разрежения внутри прибора показывает ва­куум-манометр в миллиметрах ртутного столба (от 0 до 760). Анаэростат с посе­вами также ставят в термостат.

Питательные среды. Техника посева микроорганизмов. Любая микробиологи­ческая работа и, следовательно, выпол­нение любой практической задачи свя­заны с приготовлением питательных сред для выращивания микроорганиз-

Рис. 32. Анаэростат:

/ — манометр; 2— кран для отвода воздуха; 3 — крышка; 4— емкость для размещения посевов

мов. Среды необходимы для накопления, выделения и сохранения микроорганизмов, а также для выращивания культур с целью ис­следования их обмена веществ или получения биологических пре­паратов и ценных продуктов метаболизма.

Среда должна содержать все компоненты, необходимые для конструктивных и энергетических процессов клетки: источники углерода, азота, зольные элементы, микроэлементы. Синтетичес­кие возможности микроорганизмов и способы получения ими энергии разнообразны, поэтому очень разнятся их потребности в источниках питания. Следовательно, универсальных сред, одина­ково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Разнообразие обмена веществ микроорганизмов обусловлено источниками углерода и азота; вот почему эти элементы представ­лены в средах различными веществами и именно они определяют специфичность сред.

Автотрофные микроорганизмы способны использовать в каче­стве единственного источника углерода диоксид углерода или кар­бонаты, тогда как потребность в углероде гетеротрофных микро­организмов данные соединения углерода не могут удовлетворить.

Для развития гетеротрофных микроорганизмов среда должна содержать более восстановленные соединения углерода, которые в зависимости от физиолога-биохимических особенностей организ­ма могут быть представлены различными органическими соеди­нениями, например кислотами, спиртами, углеводами, углеводо­родами.

Неодинаковы требования микроорганизмов и к источнику азо­та. В состав всех сред входят различные азотсодержащие соедине­ния. Это могут быть нитраты или соли аммония, одна или не­сколько аминокислот. Наконец, известны микроорганизмы, нуж­дающиеся в полном наборе аминокислот или белках.

Потребности разнообразных групп микроорганизмов в зольных элементах и микроэлементах удовлетворяются обычно за счет од­них и тех же минеральных солей. Поэтому так называемый «мине­ральный фон» сред для многих микроорганизмов может быть очень близким по составу.

Кроме элементов, необходимьтх для конструктивных процес­сов, среда должна содержать и энергетический материал. В средах для культивирования гетеротрофных организмов соединения уг­лерода в большинстве случаев служат и энергетическим материа­лом. В средах для хемоавтотрофных организмов эту роль выполня­ют минеральные соли.

Из вышесказанного ясно, что при составлении сред следует обязательно учитывать особенности обмена веществ микроорга­низмов. Кроме того, среды для одного и того же микроорганизма могут отличаться в зависимости от цели исследования. Например, среда для длительного сохранения микроорганизма в лабораторных условиях заметно отличается от сред, предназначенных для получения тех или иных продуктов обмена веществ.

Однако какой полноценной ни была бы среда, ее компоненты могут остаться недоступными, если активная кислотность среды (рН) не соответствует значениям, при которых возможно развитие изучаемых микроорганизмов. Поэтому в приготовленной среде проверяют значение рН и, если необходимо, доводят его до нуж­ной величины растворами кислот (HCi, H2SO4), щелочей (NaOH, КОН) или солей, имеющих щелочную реакцию (Na2CO3, >JaHCO5). В процессе стерилизации рН сред может изменяться, поэтому нередко требуется дополнительное определение его в сте­рильных средах и в случае надобности корректирование стериль­ными растворами кислоты или щелочи.

i Среды для культивирования в зависимости от состава составля­ют две группы; 1) естественные (натуральные) среды неопределен­ного или искусственного состава, 2) синтетические среды. Нату­ральные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагности­ческих целей. Примерами натуральных сред неопределенного со­става, которые широко применяют в лабораторной практике, слу­жат мясопептонный бульон, агар, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды.

(Необходимость культивирования микробов обусловлена не только выделением возбудителя болезни из исследуемого матери­ала и определением его вида, но и накоплением микробной массы для изготовления биологических препаратов: вакцин, антигенов и аллергенов. Для культивирования микроорганизмов в лаборатор­ных условиях применяют различные искусственные питательные

среды.

Питательные среды бывают: по консистенции — жидкие, плот­ные, полужидкие; по происхождению —животного, растительно­го происхождения и синтетические среды постоянного состава; по назначению —обычные, или простые, для выращивания боль­шинства микроорганизмов; специальные — для культивирования микробов, не растущих или плохо растущих на обычных питатель­ных средах; дифференциально-диагностические — употребляемые для определения родовых или видовых особенностей исследуемых бактериальных культур (гемолитических, сахаролитических, про-теолитических, редуцирующих и других свойств); селективные — для выделения микробов одного рода или вида из материала, со­держащего смесь разных видов микроорганизмов, на которых одни виды хорошо растут, а другие не растут; среды обогащения

(накопительные).

Основу многих питательных сред животного происхождения составляет мясная вода. Ее готовят из свежего нежирного говяжь­его мяса, не содержащего костей, фасций, сухожилий. Измель­ченное мясо (мелкие кусочки или фарш) заливают дистиллированной водой в соотношении 1 : 2 (на 1 кг мяса 2 л воды). Экстра­гируют 12...24 ч, кипятят 1,5...2 ч, фильтруют, добавляют дистил­лированную воду до первоначального объема, разливают в буты­ли, колбы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве.

Обычные (простые) среды. Мясопептонный бульон (МПБ) — жидкая питательная среда. Для его приготовления к I л мясной воды добавляют 1 % пептона, 0,5 % химически чистой по­варенной соли и кипятят. Мясная вода слабокислой реакции, по­этому МПБ подщелачивают — добавляют небольшое количество 10—15%-го раствора КОН или NaOH, кипятят 2...3 мин, проверя­ют рН электропотенциометром. Мясопептонный бульон фильтру­ют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам, автоклави-руют.

Мясопептонный агар (МПА) — плотная питатель­ная среда. К МПБ добавляют 2 % агар-агара (безазотистое органи­ческое вещество, полученное из морских водорослей) и кипятят до его расплавления, в горячем виде определяют рН, кипятят еще 5... 10 мин, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки или колбочки, автоклавируют. После стерилизации горячие пробирки с агаром укладывают на­клонно под углом 5...6 "С: при застывании образуется скошенная плотная поверхность. Для посева на агаровые пластинки его зали­вают в чашки Петри (рис. 33).

Мясопептонный полужидкий агар готовят так же, как и МПА; различие заключается в том, что агар-агара добавляют меньше — 0,15...0,25 %.

Специальные питательные среды. Бульон Мартена. Свиные желудки (или сычуги рогатого скота) очищают от жира, фасций, измельчают в мясорубке, заливают водой (1 : 4) и добав­ляют 1 % (к объему жидкости) соляной кислоты. Смесь выдержи­вают при 50 "С 24 ч, нейтрализуют 20%-м раствором NaOH до ще­лочной реакции по лакмусу, автоклавируют при 120 X 15 мин. Для приготовления бульона смешивают равные объемы мясной воды и полученной смеси, кипятят 10 мин, подщелачивают 20%-м раствором NaOH до рН 7,9, кипятят 30 мин, фильтруют, разлива­ют в пробирки, автоклавируют при 50,6 кПа (110 °С) 30 мин.

Агар Мартена. Добав­ление 2 % агара обеспечивает по­лучение плотной среды.

Бульон Хоттингера. Готовят из триптического гидро-лизата (перевара) мясных отхо­дов—фасций, жира, сухожилий: