Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 18 )

Для установления фаговара исследуемую культуру проверяют с набором типовых фагов, охватывающих все фаговарианты данно­го вида бактерий, определяют, к какому фагу чувствителен дан­ный штамм, что и служит его маркером.

Для идентификации микробов в объектах окружающей среды и диагностики инфекционных болезней используют метод нара­стания титра фага, который позволяет обнаружить возбудителя непосредственно в исследуемом материале в присутствии посто­ронней микрофлоры. Для этого навеску исследуемого материала без консерванта заливают МПБ в 10-кратном объеме (рН 6,8...7,0), встряхивают со стеклянными бусами 5 мин в шуттель-аппарате и разливают в две пробирки по 9 мл. В первую пробир­ку добавляют 1 мл индикаторного фага известного титра в разве­дении 1 : 100, в другую — 1 мл бульона (контроль на наличие сво­бодного фага), в третью пробирку (контроль титра фага) — 9 мл стерильного МПБ и 1 мл фага. Пробирки помещают в термостат при 37 "С на 4...5 ч. При наличии в материале микроорганизмов гомологичного фага происходит нарастание титра фага. Затем содержимое каждой пробирки разводят бульоном в 100, 1000 и 10 000 раз при 58 "С, 30 мин прогревают в водяной бане и иссле­дуют по методу агаровых слоев с индикаторной культурой. Ре­зультат учитывают через 4...5 ч по колониям фага («пятнам»). Положительным результатом считают тот, при котором титр фага в опытной пробирке увеличивается более чем в 5 раз по сравнению с контролем.

Методика рекомендуется при исследовании воды, почвы, мо­лока и другого материала.

Тема 8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ

В результате проникновения патогенных микробов в воспри­имчивый организм животного возникает инфекционный процесс, который в зависимости от состояния макроорганизма и условий среды может иметь разное течение: острое, подострое и хроничес­кое. Встречаются и стертые формы.

Специфической причиной инфекционного процесса служит возбудитель — микроб, но проявление болезни во многом зависит от состояния макроорганизма. Бывает и так, что при внедрении микроба в организм болезнь не развивается вследствие большой сопротивляемости макроорганизма. Окружающая среда может из­менить эти соотношения, понизить резистентность (сопротивляе­мость) макроорганизма, обусловливая благоприятные условия для микроба. Куры, например, обычно не болеют сибирской язвой, так как температура тела у них доходит до 42 °С — условие, небла­гоприятное для развития возбудителя. Если охладить организм ку­рицы опусканием ее в воду (при наличии в организме сибиреяз­венного микроба), то возникает болезнь.

Большинство болезней имеют свойственные им клинические признаки, определенное течение и сопровождаются характерны­ми изменениями в органах и тканях. В результате взаимодействия возбудителя с организмом вырабатываются антитела. Это дало возможность разрешить многие вопросы серологической и аллергической диагностики инфекционных болезней.

Для того чтобы доказать специфичность возбудителя, его необ­ходимо выделить из больного организма или трупа, воспроизвести подобную картину болезни после введения подопытному живот­ному и затем из трупа выделить культуру микроба, идентичную введенной.

Одни микробы, проникая в организм, размножаясь в крови и органах, вызывают его гибель, другие подобное действие оказыва­ют, выделяя на месте внедрения токсин.

Возбудителей сибирской язвы (В. anthracis), рожи свиней (Erysipelothrix insidiosa), бруцеллеза (Brucella) и других инфекцион­ных болезней выделяют из органов и тканей трупа. Возбудителя же столбняка (С. tetani) можно обнаружить только на месте вне­дрения; размножаясь, он выделяет токсин, который по нервным путям проникает в центральную нервную систему и вызывает су­дорожные сокращения мышц. Все многообразие проявления ин­фекционного процесса требует глубокого и детального знания особенностей возбудителя и клинического течения болезни.

Взятие патологического материала для лабораторного исследования. Для установления диагноза и выяснения причины гибели животных в лабораторию направляют измененные органы, ткани. Материал должен быть свежим, взят по возможности стерильно в чистую, стеклянную или другую водонепроницаемую посуду. Необходимо помнить, что органы и ткани, предназначенные для микробиоло­гического исследования, нельзя консервировать химическими ве­ществами, губительно действующими на микробов. Из такого ма­териала невозможно будет выделить возбудителя, а следовательно, установить причину смерти животного. Если нет возможности быстро доставить материал в лабораторию, то его помешают в банку с 30...40%-м стерильным водным раствором глицерина.

Для микроскопического исследования по­сылают мазки, приготовленные из органов, тканей, гноя и различ­ных выделений животного. Для гистологического ис­следования материал консервируют в 10%-м растворе фор­малина или 96%-м спирте.

Правильный отбор материала и его транспортировка в значи­тельной мере определяют успех исследований. При взятии мате­риала ориентируются на клинические признаки болезни, которые указывают на поражение той или иной системы, патологоанато-мическую картину вскрытия (изменения в различных органах — печени, легких, кишечнике и др.), а также на предварительный диагноз, поскольку для каждой инфекции характерна определен­ная локализация возбудителя в организме.

Материал для исследования берут прижизненно или посмертно (от павших или убитых с диагностической целью животных), но во всех случаях желательно от животных, не подвергавшихся лече­нию антимикробными препаратами. Патологический материал отбирают в максимально короткие после гибели сроки, так как уже через 2..,3 ч после смерти нормальная микрофлора начинает проникать в органы и ткани, что затрудняет выделение возбудите­ля в виде чистой культуры.

Чтобы избежать контаминации посторонней микрофлорой, ис­следуемый материал берут стерильно, с использованием стериль­ного инструмента и посуды для транспортировки.

Трупы мелких животных направляют в лабораторию цели­ком.

Паренхиматозные органы и их фрагменты (у крупных животных) берут, соблюдая правила асептики. Каждый орган (фрагмент) помещают в стерильную посуду, транспортиру­ют в нативном виде или консервируют одним из способов.

Трубчатые кости очищают от мышц, сухожилий, за­ворачивают в ткань, смоченную 5%-м раствором фенола, или пе­ресыпают поваренной солью и затем заворачивают в ткань.

Гной, пунктаты органов, экссудат берут при помощи стерильного ватного тампона, шприца.

Кровь (15...20 мл) следует брать при лихорадочных состоя­ниях стерильным шприцем. Кровь, а также другие жидкие мате­риалы можно отбирать стерильной пастеровской пипеткой с пос­ледующим запаиванием ее кончика.

Перед взятием мочи наружные половые органы обмывают, ополаскивают стерильным физиологическим раствором, осушают стерильным марлевым тампоном. Первую порцию мочи не берут, последующую в необходимом объеме набирают в стерильную по­суду.

Мокроту собирают до приема корма. Из трахеи ее берут при помощи стерильного трахеотубуса и стерильного ватного там­пона на проволоке. При глубоком (до бифуркации) введении там­пона возникает кашель и удается получить бронхиальную слизь. Тампон с материалом помещают в пробирку со стерильным физи­ологическим раствором. При взятии материала из носоглотки ис­пользуют специальные приборы, носоглоточные тампоны на изогнутой проволоке, носовые ватно-марлевые тампоны.

Для взятия секрета молочной железы сосок об­мывают водой, обрабатывают этанолом, ополаскивают стериль­ным физиологическим раствором, сцеживают и удаляют первую порцию; для микробиологического исследования берут последую­щие порции молока.

С п и н н о-м озговую жидкость обычно берут путем пункции при наличии менингоэнцефалитического синдрома.

При исследовании кишечника и его содержимого пере­сылают отдельные отрезки (сегменты) кишечника, перевязанные на концах лигатурами. В некоторых случаях представляющие ин­терес отрезки кишечника освобождают от содержимого, промыва­ют стерильной водой и помещают в банку со стерильным 30%-м водным раствором глицерина или насыщенным раствором хлори­да натрия. Кишечник отправляют в лабораторию вместе с регио­нарными лимфатическими узлами.

Фекалии берут стерильными ватными или ватно-марле-выми ректальными тампонами, которые вводят на 8...10 см в пря­мую кишку, а затем помещают в стерильную пробирку. Если нет возможности сразу сделать посев, используют консервирующие смеси. В противном случае нарушается исходное количественное соотношение микробных видов и размножение некоторых бакте­рий может привести к инактивации искомого возбудителя.

Консервирование, Транспортировка и хранение материала. Мате­риал помещают в стерильную стеклянную посуду (пробирки, фла­коны, банки и др.), закупоривают. При подозрении на особо опас­ные инфекции сосуды помешают в герметичный металлический пенал (ящик), который опечатывают.

Транспортировку и хранение материала до исследования про­водят таким образом, чтобы предотвратить размножение сопут­ствующей микрофлоры и инактивацию искомого возбудителя. С этой целью исследуемый материал (кусочки органов) помещают в стерильную смесь из равных объемов глицерина и физиологичес­кого раствора или помещают в термос, содержащий: 1) снег (лед) и поваренную соль (в соотношении 3 : 1), температура смеси —15...—20 °С; 2) равные части сухого льда и этанола, темпе­ратура смеси около —70 "С.

Для консервирования материала, содержащего энтеробакте-рии, используют смеси, в которых исследуемый материал должен составлять 1/3 общего объема:

глицериновая смесь: глицерин — 500 мл, физиологи­ческий раствор—1000мл; рН доводят до 7,8...8,0 добавлением 20%-го раствора гидрофосфата калия. Стерилизация дробная, те­кучим паром.

Фосфатная буферная смесь: дистиллированная вода—1000мл, дигидрофосфат калия — 0,45 г, гидрофосфат ка­лия — 5,34 г. Стерилизация 20 мин при 121 °С.

Для энтеробактерий используют также накопительные среды (селенитовая, магниевая, желчный бульон), которые должны со­ставлять 4/5 общего объема. Независимо от способа консервиро­вания фекалии транспортируют и сохраняют до посева при 2...6'С.

Упаковка и пересылка патологического материала.

Патологический материал доставляется нароч­ным. Органы или их части помешают в стеклянные банки, кото­рые плотно закрывают и опечатывают. Трупы животных перевозят в плотных деревянных ящиках с опилками, которые впитывают выделяемую жидкость. Патологический материал при особо опас­ных инфекциях (сибирская язва, сап, туберкулез, бруцеллез, эм-^ар) кладут в стеклянную или плотную металлическую посуду, закрывают и опечатывают, а затем помещают в деревянный ящик.