Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 21 )

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов использу­ют штамм Е. coli В или К 12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиоти­ка. Например, ампициллин—10мкг/мл, левомицетин — 5мкг/мл, пенициллин — 100 мкг/мл.

На среде Эндо lac-мутанты Е. coli образуют бесцветные коло­нии. Клетки Е. coli, выросшие на среде с указанной концентраци­ей антибиотика, резистентны к нему. Параллельно ставят конт­рольные посевы.

Постановка опыта трансформации.

Реципиент —- штамм Bacillus subtilis Strs (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину). До­нор — ДНК, выделенная из штамма В. subtilis Strr (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) — питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.

К 1 мл бульонной культуры В. subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем в пробирку вносят смесь 0,1 мг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл хлори­да магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдерживают в течение 5 мин.

Для определения количества образовавшихся стрептомицинус-тойчивых рекомбинантов (трансформантов) 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для опреде­ления числа клеток реципиентной культуры готовят ее десяти­кратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10~5...10~° (для получения сосчитываемого числа колоний), высе­вают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина и для кон­троля—на агар со стрептомицином (реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину). Посев инкубируют при 37 "С. На следующий день учитывают ре­зультаты опыта и определяют частоту трансформации по отноше­нию количества выросших рекомбинантных клеток к числу кле­ток реципиентного штамма.

Пример. Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реци­пиентного штамма в разведении 10~s выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси — 68 колоний рекомбинантно-го штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножений только одной бактериальной клетки то в 0,1 мл за­сеянной культуры реципиента содержится 170 ■ 10s жизнеспособ­ных клеток, а в 1 мл — 170 ■ 106 , или 1,7 ■ 108. В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинантных клеток, а в 1 мл — 680, или 6,8 ■ 102.

Постановка опыта специфической трансдукции.

Реципиент — штамм Е. coli 1ас~, лишенный 3-галактозидазного оперона, конт­ролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг — фаг X dgal, в геноме которого часть генов замещена р-галактози-дазным опероном Е. coli. Он является дефектным, т. е. неспособен вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг X dgal) с назва­нием содержащегося в его геноме бактериального оперона gal. Се­лективная среда — среда Эндо, на которой лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма приобретают красный цвет с металлическим оттенком.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага X dgal в концентрации 10й... 107 частиц в 1мл. Смесь инкубируют при 37 "С в течение 60 мин, после чего готовят ряд 10-кратных разведений (в зависи­мости от предполагаемой концентрации бактерий) для получения сосчитываемого числа колоний. Из пробирки с разведением 10~6 делают высев по 0,1 мл культуры на три чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверх­ности среды. Посевы инкубируют в течение суток, после чего от­мечают результаты опыта и вычисляют величину трансдукции по отношению числа клеток рекомбинантов (транедуктантов), об­наруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штам­ма. Так, например, после посева 0,1 мл смешанной культуры в разведении 10~6 на трех чашках со средой Эндо выросло соответ­ственно 138, 170 и 160 бесцветных колоний реципиентного штам­ма, на первой и последних чашках — 5 и 1 колоний транедуктан­тов красного цвета.

Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромо­сомы, содержащего ген leu, контролирующего синтез лейцина. До­нор—штамм E. coli К12 Hfr leu Str1. Реципиент — штамм E. coli K12F leir Sir1". Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая: КН2РО4 — 6,5 г, MgSO4 — 0,1 г, 9(NH4);.Sa,-lr, Ca(NO3)2-0,001r, FeSO4-0,0005 г, глюкоза-2 г, стрептомицин — 200 ЁД/мл, дистиллированная вода — 1 л.

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульон­ной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10~2... 10~3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри: должны вырасти только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же сре­ду высевают донорный и реципиентный штаммы, которые не бу­дут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрепто­мицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Кроме того, культуру донорного штамма высевают на селективную среду без стрептоми­цина, а культуру реципиентного штамма —на полную среду (пи­тательный агар) с антибиотиками для определения числа жизне­способных клеток. Посевы инкубируют до следующего дня при 37 °С. После подсчета числа выросших колоний определяют час­тоту рекомбинаций по отношению числа рекомбинантных клеток к реципиептным. Так, например, после посева 0,! мл смеси до-норных и реципиентных культур в разведении 10~2 выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры реципи­ента из разведения 10""6 —75 колоний.

Постановка опыта конъюгации с целью передачи R-плазмнды, контролирующей множественную устойчивость к антибиотикам

(стрептомицину (Sir1), тетрациклину (Тс1) и хлорамфениколу (Cm1)- Донор штамм Е. coli K12 R+leirStrrTcrCms. Реципиент — штамм E.coli K12 Rrleu+StrrTcsCms. Селективная среда —мини­мальная глюкозосолевая среда, содержащая упомянутые антибио­тики в концентрации 50 мкг/мл каждый.

В стерильную пробирку вносят по 1 мл 3~часовой бульонной культуры донора и реципиента. Смесь инкубируют при 37 °С в те-

чение 2 ч и высевают в объеме 0,1 мл на чашки с селективной сре­дой, содержащей 3 антибиотика. На данной среде вырастут только колонии рекомбинантов (трансконъюгантов), которые приобрели резистентность к данным антибиотикам. Отсутствие роста донор-ного и реципиентного штаммов на этой среде объясняется тем, что донорный штамм нуждается в лейцине, а второй чувствителен к антибиотикам.

Частоту формирования трансконъюгантов определяют по отноше­нию числа клеток трансконъюгантов к числу клеток реципиентного штамма. Так, например, при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении 10"4 на глюкозосолевую среду с лейцином полу­чено 20 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси — 60 коло­ний трансконъюгантов.

Определение Col-плазмид (колицикогенных факторов).

Исследуе­мые культуры Е. coli засевают методом укола в питательный агар в чашке Петри (7...8 уколов на 1 чашку). Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего на внутреннюю поверхность чашки помещают кусочек ваты, смоченный хлороформом, в парах которого погибают бактерии. Затем по поверхности агара равно­мерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного до 45 °С полужидкого (0,7 %) питательного агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной индикаторной культуры. В качестве таковой подбирается наиболее чувствительная к данному типу колицина культура Е. coli. Через 18...24ч инкубации посевов при 37 °С учи­тывают результаты опыта. Вокруг посевов исследуемых культур, продуцирующих колицины, появляются прозрачные зоны подав­ления роста индикаторного штамма.

Определение колицинотипа. В питательный агар в чашке Петри методом укола засевают эталонные штаммы бактерий с известным колициногенотипом. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего бактерии убивают в парах хлороформа. Затем по поверх­ности агара равномерно распределяют Змл расплавленного и осту­женного полужидкого агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульон­ной культуры Е. coli неизвестного колициногенотипа (например, Col A, Col В и др.). Через 18...24ч отмечают результаты опыта по нали­чию или отсутствию роста. Исследуемая и индикаторная культуры имеют один и тот же колициногенотип, т. е. содержат идентичные Col-плазмиды. В противном случае вокруг эталонных штаммов по­являются прозрачные зоны подавления роста бактерий.

Метод генных зондов.

Используют достаточно часто для иден­тификации бактерий. От обычной ДНК —ДНК гибридизации этот способ отличается использованием не тотальной ДНК, а оп­ределенного ее фрагмента (зонда), содержащего известный ген (генетический маркер).

Предварительно создают «банк генов» изучаемой бактерии. С этой целью бактериальную ДНК расщепляют эндонуклеазами, фрагменты ДНК разделяют с помощью электрофореза, методом трансформации определяют их генетические характеристики, от­бирают нужный фрагмент ДНК и при помощи лигазы включают в плазмиду, которая служит вектором. Плазмиду с интегрирован­ным известным геном вводят в какой-либо бактериальный штамм, обычно достаточно легко культивируемый. Получают большое ко­личество биомассы, содержащей ДНК-зонд. Выделяют плазмид-ную ДНК, метят ее радиоактивным изотопом, затем эту меченую ДНК гибридизируют с ДНК изучаемой бактерии. Методом ауто-радиографии выявляют относительную частоту гибридизации маркера с изучаемой ДНК и по этому показателю судят о генети­ческом родстве известной бактерии — донора ДНК и исследуемой бактерии.

Полимеразная цепная реакция — ПЦР (polymerase chain reaction — VCR). Принцип реакции состоит в том, что при помощи ДНК-полимеразы in vitro многократно син­тезируют копии определенного участка ДНК (амплификация — накопление).