Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 27 )

Адсорбция антигена (бактерий, вирусов) на поверхности эрит­роцитов не всегда проявляется образованием видимого осадка; кроме того, РГА неспецифична, потому что эритроциты одного и того же вида животного могут адсорбировать различные антигены.

Специфической является реакция пассивной (непрямой) гемаг­глютинации (РПГА) (рис. 49). Для ее постановки предварительно готовят эритроцитарный диагностикум (эритроциты, на которых адсорбирован антиген). С этой целью стерильно получают кровь

барана (или петуха), дефибринируют ее и несколько раз отмывают в фосфатно-буферном растворе (рН 7,2) при 3...5-кратном цент­рифугировании. Надосадочную жидкость сливают, концентрацию эритроцитов доводят до 2,5 % (1 : 40). К 2,5%-й взвеси эритроци­тов добавляют в равном объеме (по 1 мл или по 0,5 мл) взвесь ис­следуемого вида микроба в концентрации 5...10 млрд клеток в 1 мл. Эритроциты легко адсорбируют антиген полисахаридной природы. Для адсорбции антигена белковой природы эритроциты предварительно обрабатывают танином в разведении 1:20 000. Эритроциты в комплексе с добавленным антигеном оставляют для сенсибилизирования (адсорбции) на 2 ч в термостате (37 °С), за­тем вновь центрифугируют при оборотах З...4тыс. мин""' в течение 5 мин с фосфатно-буферным раствором.

Полученный эритроцитарный диагностикум вносят в пробир­ки (или лунки в плексигласовой доске) и добавляют к нему стан­дартную иммунную сыворотку.

В положительных случаях произойдет РГА — выпадение эрит­роцитов в характерный хлопьевидный или зернистый осадок, рас­пределенный по всей поверхности дна пробирки (гемагглютинат). Значит, исследуемый вид микроба (антиген) специфичен антите­лам иммуносыворотки. В отрицательных случаях несклеенные эритроциты осядут на дно в виде небольшого ровного кружочка.

Для подтверждения достоверности результатов РПГА ставят ре­акцию задержки (торможения) феномена гемагглютинации (РЗГА) или ее модификацию — реакцию нейтрализации антител (РИА).

Рис. 49. Реакция пассивной гемагглютинации (схема): Эр — эритроциты; АГ— антиген; AT— антитело

Методика постановки РЗГА. Сущность заключается в том, что реакцию агглютинации ставят со специфической диагностической сывороткой и испытуемым антигеном (исследуемый вид микроба используют как антиген). Эту смесь выдерживают 1 ...2 ч при 37 °С,

затем добавляют эритроциты. Если испытуемый антиген гомоло­гичен антителам диагностической сыворотки, они взаимодейству­ют друг с другом и добавленные эритроциты не агглютинируют — результат реакции положительный. Если испытуемый антиген не гомологичен антителам сыворотки или отсутствует в исследуемом материале, добавленные эритроциты адсорбируют антиген и про­исходит РГА —результат РЗГА отрицательный, вид испытуемого микроба (антигена) не установлен,

Методика постановки РНА. Сущность заключается в том, что в равных объемах смешивают диагностическую иммунную сыворот­ку с различными разведениями исследуемого материала (искомого антигена), оставляют для контакта на 1...2ч, затем добавляют эритроциты, сенсибилизированные определенным (известным) антигеном, специфическим по отношению к антителам сыворот­ки (эритроцитарный диагноста кум). Когда искомый антиген всту­пает в реакцию с антителами сыворотки, происходит их нейтрали­зация и добавленные эритроциты не агглютинируют, РГА не про­исходит — результат РНА положительный. Если в исследуемом материале не содержится антиген, специфический к антителам используемой сыворотки, нейтрализации антител не будет; поэто­му при добавлении эритроцитарного диагностикума проявляется агглютинация эритроцитов (гемагглютинация), а результат РНА отрицательный.

Реакция нейтрализации антител — высокочувствительный ме­тод обнаружения антигена не только во взвеси живых (или уби­тых) бактерий, но и во взвеси растертой ткани различных органов, нативных и гретых секретах и экскретах больного организма.

Реакция преципитации (РП).

Основана на том, что при соедине­нии антигена (преципитиногена) со специфическими антителами (преципитинами), находящимися в соответствующей сыворотке, образуется осадок — преципитат. В РП используют растворимые антигены, получаемые путем экстракции из разрушенных бакте­рий или извлеченные из тканей. Преципитиногены резистентны к воздействию высокой температуры (кипячению, автоклавирова-нию) и гниению. Постановка РП может осуществляться в пробир­ках в жидкой среде и в чашках Петри (или на предметном стекле) в плотной агаровой среде (диффузионная преципитация).

Для диагностики сибирской язвы в ветеринарии наиболее рас­пространена реакция кольцепреципитации по Асколи (1910). Для постановки реакции кольцепрецилитации не нужна специфичес­кая преципитирующая сыворотка биофабричного производства. Антигеном в РП служит фильтрат живой или убитой нагреванием микробной культуры или экстракт из исследуемого материала. Экстрагирование производят либо кипячением, либо длительным (18...24 ч) воздействием физиологического раствора NaCl при комнатной температуре. Экстракт фильтруют через асбестовую вату до полной прозрачности.

В узкие пробирки Уленгута диаметром 4 мм пастеровской пи­петкой вносят 0,3...0,4 мл сыворотки. Одновременно ставят в 6 пробирках контрольные реакции. Антиген (другой пи­петкой) осторожно добавляют (наслаивают) по стенке пробирки, не касаясь пипеткой сыворотки. Пробирку держат вертикально. Если же в пробирку сначала внести антиген, то сыворотку нужно подслаивать под антиген. Для того чтобы предотвратить смешение компонентов, пипетку с сывороткой опускают на дно пробирки и осторожно выпускают сыворотку в том же объеме, что и антиген (сыворотка имеет большую плотность). В том и другом случае при положительном результате на границе двух жидкостей почти сразу или в течение 1...2мин образуется резко ограниченное беловатое кольцо или диск — преципитат.

Реакция диффузионной преципитации. Осуществляют путем наслаивания антигена на поверхность агара, содержащего специфическую сыворотку, или путем внесения сы­воротки в специальные лунки в агаре, содержащем антиген (по Аухтерлони, 1948) (рис. 51).

Широкое использование получил метод диффузионной преци­питации. В застывшем в чашках Петри или на предметном стек­ле агаровом геле делают углубления (луночки) на некотором расстоянии друг от друга. В одну из них вносят специфическую сыворотку, в другие, расположенные вокруг первой, — разные пробы антигена (исследуемый материал). Оба компонента в лу­ночках (сыворотка и исследуемый материал) диффундируют во встречном направлении в слое агарового геля. На месте встречи специфических антиген — антитело выпадает сероватый преци­питат.

 

Рнс. 51. P1I в геле по Аухтерлони:

/ — лунки со сравниваемыми антигена­ми (периферические); 2— полосы пре­ципитации; 5 —пластинка агарового геля; 4 — лунка с иммунной сывороткой

Полосы преципитации образуются только в зоне эквивалентности, т. е. там, где все антитела связаны с антигеном. (Если в жидкой среде соединить эквивален­тные количества реагентов,

то в надосадочной жидкости после формирования преципитата не будет свободных антигена и антител.)

При изучении в РДП различных антигенов возможны три ва­рианта результата (рис. 52...54).

1. Реакция идентичности: слияние линий преципитации, относящихся к двум соседним антигенам (у сравниваемых антигенов гомологичные детерминанты — антигены оценивают как идентич­
ные).

2.  Реакция не идентичности: пересечение линий преципитации (у сравниваемых антигенов гомологичные антигенные детерми­нанты отсутствуют).

3.  Реакция неполной идентичности: неполное пересечение лиий преципитации с формированием так называемой «шпоры» (у одного из антигенов помимо гомологичных есть и специфические детерминанты, которые второй антиген в составе своей молекулы не несет).

Рис. 54. РДП (3-й вариант). Линии преципита­ции частично сливаются; сравниваемые антиге­ны имеют гомологичные (общие и гетерологич-ные) детерминанты: АГ-ав, АГ-в — сравниваемые антигены; в —гомоло­гичная (обшая) антигенная детерминанта в сравни­ваемых антигенах; а — специфическая антигенная детерминанта антигена АГ-ав; А Т-ав — антитела к антигенам АГ-ав, АГ-в; ЛП-в — линия преципитации гомологичных антигенов в; ЛП-а — линия пре­ципитации антигена

С помощью реакции диффузионной преципитации можно об­наруживать антитела в сыворотке крови и определять их титр. В этом случае в центральную лунку вносят известный растворимый антиген (бактериальный, вирусный), а в периферические — раз­личные разведения исследуемой сыворотки крови {рис. 55).

Для того чтобы полосы преципитации были более выраженны­ми, пластины обрабатывают солями кадмия: пластины с готовым гелем отмывают в физиологическом растворе и заливают 0,65%-м раствором сульфата кадмия. В результате через несколько минут полосы преципитации становятся ярче в несколько раз.

Для постановки РП среда должна быть нейтральной. В кислой среде образуется неспецифический осадок; щелочная среда тор­мозит проявление специфической РП.

Реакция флокуляции. Используют для выявления токсинов и определения активности антитоксических сывороток. В пробир­ки, содержащие по 10 мл определенного токсина, добавляют убы­вающие количества специфической токсину антитоксической сы­воротки (1,0; 0,9; 0,8... 0,3 и т. д.), полученной от гипер-иммунизированного живот­ного (например, лошади). Пробирки встряхивают, ос­тавляют при комнатной температуре, а через неко­торое время в них наблюда­ют опалесценцию, перехо-