Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 48 )

При темнопольной микроскопии препарат «раздавленная кап­ля» исследуют в водной иммерсии с объективом х 40 и окулярами х7 или х 10. Возбудитель в этом случае виден как спиралевидная клетка с 3...I2 правильными витками размером (7...9) х х (0,3...0,4) мкм, движущаяся змеевидно-поступательно. При тем­пературе 22 °С наблюдают изгибание клетки и скользящее движе­ние, а при 37...42 °С —поступательное. У большинства больных дизентерией свиней в препарате «раздавленная капля» в одном поле зрения обнаруживают 5... 10 спирохет и более. В препаратах, окрашенных по Граму, видны грамотрицательные извитые клетки со строением, типичным для спирохет. Клетки возбудителя хоро­шо окрашиваются по Романовскому—Гимза, фуксином Пфейф-фера. Сходные по морфологии с Serpulina hyodysenteriae вибрионы, обитающие в кишечнике, отличаются тем, что толщина их клетки в 2...4 раза больше, с тупыми концами, движение вращательное вокруг длинной оси.

Культурально-биохимические свойства. Возбудитель —строгий анаэроб. Температурный оптимум роста 36...38°С (при 25...30°С не растет), рН 7,0...7,2. Для первичного выделения используют селективные среды. Например, кровяной агар со спектомицином готовят следующим образом: к перевару Хоттингера добавляют 0,001 % резазурина, 0,5 % хлорида натрия, 0,25 % глюкозы, 1 % пептона, 2 % агара, кипятят, через среду про­пускают азот или диоксид углерода в течение 10...15 мин, устанав­ливают рН 7,0...7,2, вносят 0,05 % гидрохлорида цистеина. Среду автоклавируют при 110°С в течение 30 мин, охлаждают до 40...45 "С, пропуская при этом через среду стерильный газ без кис­лорода, после чего вносят 10 % дефибринированной крови барана (или крупного рогатого скота) и 400 мкг/мл спектомицина. Среду разливают в атмосфере оксида углерода. На кровяном агаре через 48...96 ч инкубирования при 38 °С вырастают плоские просвечива­ющие колонии диаметром 0,5...3 мм с зоной р-гемолиза.

Культивируют также в жидкой или полужидкой среде, содер­жащей сердечно-мозговую вытяжку и 10 % эмбриональной теля­чьей или кроличьей сыворотки. На кровяном агаре через 48—96 ч инкубирования при 38 °С вырастают плоские просвечивающие ко­лонии диаметром 0,5...3мм с зоной р-гемолиза. В полужидком сывороточном агаре возбудитель растет в виде беловатого диффуз­ного облачка ближе к поверхности среды.

После изучения морфологических и культуральных свойств у выделенных бактерий исследуют ферментативную активность. Патогенные для свиней культуры гидролизуют эскулин, не ферментируют фруктозу, утилизируют пируват. При сбраживании глюкозы образуют водород, диоксид углерода, ацетат; нитраты не восстанавливают; растут на средах, содержащих 6,5 % хлорида на­трия, но не растут на средах с 1 % глицина.

Тема 25. МИКОПЛАЗМЫ

Возбудитель перипневмонии крупного рогатого скота (Mycoplasma mycoides). По современной классификации принадлежит к порядку Mycoplasmatales, семейству Mycoplasmataceae, роду Mycoplasma.

Перигтневмония (плевральное воспаление легких) крупного ро­гатого скота характеризуется подострым и хроническим течением. Температура тела повышается до 40 °С (и выше), у животных болез­ненный сухой кашель, прекращается удой, появляется запор, моча темного цвета с высоким содержанием белка. У тяжелобольных жи­вотных слизистое, иногда с примесью крови, истечение из носа.

Для прижизненной диагностики используют бронхиальную слизь, секрет молочной железы, мочу. После убоя исследуют плев-ритический экссудат, лимфу, медиастинальные, бронхиальные, предлопаточные лимфоузлы, секвестры (пораженные участки) легких. При необходимости указанные органы консервируют в 30...40%-м водном растворе глицерина или в 0,5%-м растворе фе­нола.

Микробиологические исследования. Изуче­ние патологического материала включает микроскопирование препаратов, окрашенных по методу Романовского — Гимза (про­должительность окраски 48 ч), высев на специальные питательные среды. При атипичных клинических признаках болезни и нечетко выраженных патологоанатомических изменениях прибегают к биопробе. Микоплазмы перипневмонии —полиморфные, нитча­тые, коккоподобные, звездчатые формы размером 125,..25Онм. У микоплазм нет клеточной стенки, чем и объясняется их полимор­физм. Клеточное содержимое (цитоплазма) снаружи покрыто ци-топлазматической мембраной.

Культурально-биохимические свойства. Микоплазмы — аэробы. Оптимальная температура роста 37..,38 "С, рН среды 7,8...8,0. Чистую культуру получают при посе­ве на бульон и агар Мартена с добавлением 8 % сыворотки крови. В жидкой среде рост проявляется через 2...3 сут очень слабым по­мутнением (легкой опалесценцией), а на сывороточном агаре — в виде слизистого налета. Микроб не разжижает желатину, не обра­зует индол, ферментирует крахмал, глюкозу, маннит, гликоген; фильтраты культур лизируют эритроциты лошади. Культивирует­ся на куриных эмбрионах.

Биопроба. Подкожно заражают телят, так как лаборатор­ные животные невосприимчивы к возбудителю.

Для массового обследования животных применяют РСК и реак­цию конглютинации (РК). Методика постановки РСК общепринятая (см. Общая часть). Антигеном для РСК и РК служит либо вторич­ная лимфа, полученная из плевральной полости после эксперимен­тального подкожного заражения теленка, или бульонная культура возбудителя. Лимфу, разведенную дистиллированной водой (1:4; 1:6), прогревают 10 мин при 100 °С, консервируют 0,5%-м раство­ром фенола. Нестерильный материал фильтруют и разводят бульо­ном Мартена (I : 80). В свежем материале посторонняя микрофлора отсутствует. РСК выявляют субклинические формы заболевания.

Возбудитель контагиозной агалактии коз и овец (Mycoplasma mycoides, var. agalactiae). Вызывает заболевание, характеризующее­ся поражением главным образом молочной железы с отсутствием секреции молока; возможно поражение глаз (кератит, конъюнкти­вит) и суставов. При остром течении болезни животные погибают через 5...8сут.

Для микробиологического исследования при жизни использу­ют молоко (или секрет вымени при агалактии), выделения из по­раженных глаз, а посмертно — паренхиматозные органы, лимфо­узлы, содержимое абсцессов.

Из патологического материала готовят мазки-препараты и про­изводят посевы на питательные среды. Материал наносят на пред­метное стекло, распределяют тонким слоем и высушивают 24 ч. Для удаления солей и растворимых белков препарат погружают в дистиллированную воду на 10 мин, высушивают, фиксируют эти­ловым спиртом 10 ...15 мин и окрашивают по метолу Романовско­го — Гимза (до 48 ч).

М. mycoides, var. agalactiae — полиморфный микроб величиной 125...250 мм, аэроб. Культивируют в бульоне и агаре Мартена с до­бавлением 15...20 % сыворотки при рН 7,4...8,0 и температуре 37 "С. Растет также на среде Хоттингера с добавлением сыворотки и 1 ...2 % лактозы. На сывороточном агаре с лактозой рост в виде мел­ких колоний (лучше рассматривать под лупой). Колонии молодых культур легко снимаются с поверхности плотной среды, старые культуры — с трудом, так как прорастают в глубь среды. Микоплаз-мы культивируют в некоторых культурах клеток (например, клетки почки эмбриона овцы, куриные фибробласты и др.).

Лабораторные животные невосприимчивы к возбудителю ага­лактии. Поэтому для биопробы используют овец и коз. Чистую культуру вводят через сосковый канал или внутривыменно (мож­но также подкожно, интраторакально). Инкубационный период длится 1...24сут. Бактериологическую диагностику (из-за трудно­сти проведения) осуществляют только для первичного установле­ния агалактии в хозяйстве. Решающее значение имеет выделение возбудителя из молока, суставов.

Возбудитель респираторного микоплазмоза птиц. По современ­ной номенклатуре возбудитель называют Mycoplasma gailisepticum.

Морфологически микроб не отличается от других микоплазм: полиморфен, размер колоний до 500 мкм. Препараты-мазки окра­шивают по Гимза (2 ч), предварительно фиксируя их метиловым спиртом. Исследуют соскобы со слизистой оболочки гортани, си­нусов, трахеи и легких.

Культивирование. Предварительно готовят суспензию исследуемого материала на курином бульоне из расчета 1 : 10, обезвреживают от банальной микрофлоры добавлением 0,1 мл ра­створа ацетата таллия (1: 400) и 2500 ЕД пенициллина на 1 мл сус­пензии, выдерживают при комнатной температуре 40...60 мин, за­тем высевают на питательные среды. Банальную микрофлору можно удалить и центрифугированием суспензии при 3500...4000 мин"1 в течение 30...40 мин. Надосадочную жидкость обрабатывают пенициллином или пропускают через фильтроваль­ные пластинки Зейтца, а фильтрат уже обрабатывают пеницилли­ном (2500...3000 ЕД на 1 мл жидкости).

Для культивирования чаще используют среду Эдварда, состоя­щую из отвара сердечной мышцы крупного рогатого скота с до­бавлением I % пептона; рН среды 8,0. Перед использованием до­бавляют 20 % стерильной сыворотки крови лошади (или рогатого скота, свиней, птиц) и 10 % экстракта дрожжей. При добавлении 2 % агара получают плотную, а при добавлении 0,3 % агара — по­лужидкую среду. Рост в жидкой среде 24...48 ч. На плотной среде появляются мелкие прозрачные колонии, шероховатые, непра­вильной формы, вдавленных в центре. Культивировать можно и на 7...9-суточных куриных эмбрионах, заражая последних в жел­точный мешок или на хориоаллантоисную оболочку. Эмбрионы погибают через 5...8 сут.

Биопроба. Ставят на индюшатах или цыплятах 1...2-ме­сячного возраста. Суспензию патологического материала в дозе 0,5 мл инъецируют интраназально или интратрахеально, или в грудной воздухоносный мешок.

Серологическое типирование. С этой целью применяют РГА. В РГА определяют гемагглютинирующую актив­ность культуры микоплазм: 5-суточную культуру микоплазм на жидкой среде Эдварда (или S...lO-суточную на среде Мартена или на курином бульоне с 20 % сыворотки лошади и 0,5 % глюкозы) разводят в физиологическом растворе от 1 :2 до 1 :32. Отдельно готовят 1%-ю взвесь отмытых эритроцитов кур. Затем к разным разведениям культуры добавляют по 0,5 мл взвеси эритроцитов; пробирки встряхивают, выдерживают при комнатной температуре 45...60 мин и учитывают результат.