Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 22 )

ПЦР — циклический процесс, каждый цикл которого включает в себя три стадии.

1.  Тепловая денатурация (95 °С) исследуемой ДНК. При этом
разрушаются водородные связи, соединяющие парные основания,
и цепи ДНК расходятся, т. е. образуются одноцепочечные ДНК,
которые доступны для праймерон (затравок) и ДНК-полимеразы.
Длительность процесса 1 мин.

2.  Посадка (отжиг) праймеров на комплементарные участки
двух антипараллельных цепей ДНК. Праймеры представляют собой
два синтетических олигонуклеотида из 20...30 нуклеотидов, каждый
из которых комплементарен противоположной цепи ДНК в участ­
ках, о!"раничивающих выбранный сегмент ДНК возбудителя. Таким
образом праймеры ограничивают специфический для возбудителя
участок ДНК. Праймеры добавляют в реакционную смесь в избыт­
ке, что позволяет им занять свои комплементарные участки до того,
как произойдет соединение (ренатурация) одноцепочечных ДНК в
двухцепочечную. Длительность стадии 1...2 мин.

3.  Процесс достройки (элонгации) праймера из внесенных в
реакционную смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов при участии
ДНК-полимеразы. Используют обычно термостабильную ДНК-
полимеразу термофильной бактерии Thermos aquaticus (Taq-поли-
мераза), что позволяет вести полимеризацию при оптимальной
температуре 70...75 °С. При синтезе ДНК праймеры включаются в
ее молекулу. Синтез ДНК с помощью полимеразы протекает толь­
ко между праймерами; при этом удваивается число копий именно
этого участка ДНК. Молекула ДНК, синтезированная при помо­
щи одного праймера, может служить матрицей для синтеза комп-

лементарной ДНК при помощи другого праймера. Длительность этой стадии 1...2мин.

По завершении 1-го цикла реакцию тормозят и ДНК вновь подвергают температурной денатурации. При охлаждении избы­точные праймеры опять гибридизируются с цепями исходной и вновь синтезированной ДНК. Добавление ДНК-полимеразы обес­печивает 2-й цикл полимеризации. Таким образом можно провес­ти несколько десятков циклов ферментативного удлинения прай-меров, в результате число сегментов ДНК, ограниченных с обеих сторон праймерами, с каждым циклом увеличивается экспонен­циально. Следовательно, используя метод ПЦР, можно in vitro из­бирательно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион раз и более. Факт увеличения числа фрагментов ДНК служит доказательством присутствия в ис­следуемом образце гомологичной ДНК, т. е. возбудителя инфек­ционной болезни.

Для практического использования ПЦР необходимо синтези­ровать праймеры, комплементарные 3'-концам цепей копируемой ДНК-матрицы и ограничивающие копируемый фрагмент ДНК. Их выбирают на основе участков генома возбудителя с расшифро­ванной нуклеотидной последовательностью и устойчивых к гене­тическим перестройкам. Например, для идентификации C.psittaci были предложены праймеры, выбранные на основе гена, кодиру­ющего белок наружной мембраны, или на основе гена, кодирую­щего 16s pPHK; для идентификации бруцелл был выбран праймер на основе гена, кодирующего белок внешней мембраны 31 КДа, и т. д.

Для проведения ПЦР-диагностик и необходимы следующие компоненты: водные растворы дезоксинуклеозидтрифосфатов че­тырех типов (gATO, gTTO, glTO, gUTO, 10 мМ, рН 7,0); первый праймер (5 мМ); второй праймер (5 мМ); фермент Taq-полимера-за (5 ЕД/мкл); амплифицируемая ДНК (-1 мкг); ионы Mg2f для обеспечения работы полимеразы (25 мМ); буферный раствор (10-кратный концентрат), например трис-соляная кислота (рН 6,8...7,8) с добавлением бычьего альбумина и неионных детерген­тов.

Указанные компоненты вносят в пробирку, например, в следу­ющих количественных соотношениях: раствор дезоксинуклеозид­трифосфатов — 8 мкл, буфер — 10 мкл, амплифицируемая ДНК — ~1 мкг, праймеры —по 1„.5мкл, полимераза — 0,5 мкл, дистил­лированная вода — до 100 мкл. Для предотвращения испарения на жидкость в пробирке наслаивают минеральное масло. На первом этапе проведения ПЦР денатурируют ДНК, затем в реакционную смесь, содержащую дезоксинуклеозидтрифосфаты, вносят поли-меразу, помещают в амплификатор или термоциклер (программи­руемый термостат). Амплификацию проводят в термоциклере по заданной программе, например: 90 °С — 1 мин, 60 °С— 1 мин, 72 °С — 1мин (5 циклов), 93 °С — 1 мин, 57 "С - 1 мин, 92 °С — I мин (5 циклов); 93 "С — 1 мин, 55 °С — I мин, 72 °С — 3 мин (25 циклов).

После завершения амплификации следует этап обнаружения продуктов ПЦР — амплификонов. Молекулы ДНК и их фрагмен­ты разделяют электрофорезом в агаровом геле. ДНК в геле окра­шивают бромидом этидия с последующим анализом и фотографи­рованием фореграмм под УФИ. Специфичность полосы ампли-фицированной ДНК подтверждают сравнением с маркерными фрагментами и ДНК-стандартом. Дополнительно специфичность амплификона можно подтвердить путем гибридизации со специ­фическим радиоактивным зондом.

Объектом исследования в ПЦР могут служить как ткани, со­держащие возбудитель, так и культуры возбудителя. Из материала обычно тем или иным способом извлекают ДНК. В зависимости от характера материала методы его обработки варьируют.

Ценность ПЦР-диагностики возрастает, когда необходимо об­наружить возбудителей инфекционных болезней или труднокуль-тивируемых, или находящихся в нетипичной форме (L-формы бактерий), а также выявить гены, контролирующие тот или иной фактор патогенности микроорганизма. В повседневной диагнос­тической практике обычно ограничиваются установлением факта патогенности микроорганизма; при оценке биопрепаратов необ­ходимы количественные характеристики вирулентности микроор­ганизма, взятого для заражения животного.

Тема 10. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Для оценки санитарно-гигиенического состояния различных объектов окружающей среды предназначены санитарно-бактерио-логические исследования, целевое назначение которых состоит в определении эпизоотической безопасности. Выявление патоген­ных микроорганизмов служит показателем эпизоотической опас­ности. Однако прямое обнаружение их сопряжено с рядом труд­ностей, связанных прежде всего с низкой концентрацией данных микроорганизмов, которые, как правило, медленно размножаются в воде, почве. Поэтому в санитарно-микробиологической практи­ке применяют косвенные методы, основанные на определении микробной обсемененности того или другого объекта и на обнару­жении в нем так называемых санитарно-показательных бактерий.

О микробной обсемененности судят по микробному числу — общему количеству микроорганизмов, содержащихся в единице объема или массы исследуемого объекта (1 см3 воды, 1 г почвы, 1 м3 воздуха). Содержание санитарно-показательных бактерий оценивают по двум показателям — титру и индексу. Титром называется тот минимальный объем или масса, в которых обнаружива­ются данные бактерии; индексом — число санитарно-показатель-ных бактерий, содержащихся в 1 л жидкости, 1 г плотных веществ, 1 м3 воздуха.

К санитарно-показательным бактериям принадлежат представи­тели облигатной микрофлоры организма животных, для которых средой обитания служат кишечник или дыхательные пути. Они об­ладают следующими свойствами: 1) постоянно выделяются в боль­шом количестве с калом или капельками слизи из дыхательных пу­тей; 2) не имеют других мест обитания; 3) способны сохраняться в окружающей среде в течение тех же сроков, что и патогенные бак­терии, паразитирующие в кишечнике или дыхательных путях; 4) неспособны интенсивно размножаться на каких-либо объектах вне организма хозяина и изменять свои свойства. Все перечисленные признаки присущи ряду бактерий, которые признаны санитарно-показательными для различных объектов окружающей среды.

Санитарно-показательные бактерии группы кишечных палочек (БГКП) принадлежат к разным родам семейства энтеробактерий. Их дифференцируют по различным признакам.

Обнаружение Е. coli в разных объектах окружающей среды, пи­щевых продуктах считается наиболее достоверным показателем свежего фекального загрязнения. Наличие в этих же объектах бак­терий родов Citrobacter и Enterobacter указывает на относительно давнее фекальное загрязнение.

perfringens, С. sporogenes и других клостридий в почве свидетельствует о ее загрязнении фекалиями, причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно сохраняться в окружающей среде (в частности, в почве).

Обнаружение в объектах окружающей среды Streptococcus faecalis также свидетельствует о фекальном загрязнении.

Термофильные бактерии включают группу разных бактерий (Lactobacillus lactis, Streptococcus thermophilus и др.), размножаю­щихся при температуре 60 X и выше. Они не являются постоян­ными обитателями кишечника животных и не служат критериями фекального загрязнения окружающей среды. Резкое увеличение числа этих бактерий в самосогревающемся навозе и компостах может свидетельствовать о загрязнении почвы разлагающимися отбросами.

Бактерии, принадлежащие к роду Proteus (P. vulgaris и др.) се­мейства Enterobacteriaceae, широко распространены в природе. Эти гнилостные бактерии в большом количестве встречаются на разлагающихся останках животных и растений. Обнаружение этих бактерий в каких-либо пищевых продуктах свидетельствует о гни­лостном распаде.

Микрофлора воды. Водопроводную воду засевают в объеме 1 мл, из открытых водоемов — в объемах 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10... 12 мл расплавленного и остуженного до 45...50°С питательно­го агара, который тщательно перемешивают с водой. Посевы ин­кубируют при 37 °С в течение 1...2 сут. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инку­бируют при 37 "С в течение суток, а другую — 2 сут при 20 °С. За­тем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глу­бине среды колоний и вычисляют микробное число воды — количе­ство микроорганизмов в I мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды. Коли-mump воды измеряется минимальным количеством воды (мл), в котором обнаруживаются БГКП, коли-индекс —- коли­чеством БГКП, содержащихся в 1 л исследуемой воды. Эти пока­затели определяют титрационным (бродильным) методом или ме­тодом мембранных фильтров.