Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 20 )

После этого прижигают поверхность сердца, печени, почки и других органов, пипеткой прокалывают нужный участок, насасы­вают небольшое количество крови и высевают ее на питательные среды, соблюдая стерильность. Если в органах имеются очаги поражения, то из них пастеровской пипеткой также производят по­сев на питательные среды. Наряду с посевами готовят и препара­ты-отпечатки из тканей органов: отрезают кусочек печени, селе­зенки, почки, лимфатических узлов и к поверхности разреза при­кладывают предметное стекло; препарат высушивают, фиксируют, окрашивают и микроскоп ируют.

После окончания работы трупы утилизируют: помещают в ме­таллические бачки, заливают хлорноизвестковым молоком или 5...10%-м раствором хлорной взвеси, затем сжигают.

Вирулентность (токсигенность) микроба изме­ряют в специальных условных единицах: абсолютная летальная доза {Del — dosis certae letalis) вызывает гибель 100 % зараженных животных; 50%-я летальная доза (LD50) — 50 % зараженных жи­вотных; 50%-я инфицирующая доза (Ш50) вызывает заболевание у 50 % зараженных животных. LD5q и Ш5о — наиболее точные пока­затели, поскольку отражают чувствительность к возбудителю (ток­сину) большинства взятых в опыт животных, a Del показывает чувствительность наиболее устойчивых особей.

Для расчета LD50 исследуемой культуры микроорганизма используют один из приведенных методов. Готовят суспензию бактерий с известным содержанием микробных клеток в едини­це объема. Затем делают последовательные (2, 5, 10-кратные) разведения суспензии на стерильном физиологическом раство­ре и равные объемы каждого разведения вводят (подкожно, внутрибрюшинно и т. д.) чувствительным лабораторным живот­ным. Если определяют летальный эффект, то учитывают число погибших животных и рассчитывают LD5o ■ Поскольку обычно ни одна из доз возбудителя не приводит к гибели строго 50 % зараженных животных, то LD5o определяют статистическими методами.

Тест на плазмокоагулазу. Коагулаза — фермент бактерий (стафилококков), который в сочетании с некоторыми компонентами сыворотки коагулирует плазму. Благодаря коагула-зе вокруг стафилококковых поражений образуется фибринозный барьер, облегчающий персистенцию бактерий в тканях, кроме того, отложения фибрина на поверхности бактериальных клеток затрудняют их фагоцитоз.

Бактериальную массу исследуемой культуры, снятой петлей с поверхности агаровой среды, смешивают с 0,5 мл плазмы крови кролика (человека), не разведенной или разведенной стерильным физиологическим раствором в соотношении 1: 4, инкубируют при 37 °С; результаты учитывают через 4 и 24 ч. Положительная реак­ция — образование сгустка.

Тест на гиалуронидазу. Гиалуронидаза — фермент, расщепляющий гиалуроновую кислоту и, как следствие, деполиме-ризуюший межклеточное вещество. Рассматривают как фактор инва-зивности бактерий. Получение гиалуронового субстрата (из пупоч­ных канатиков)—довольно сложная процедура. На практике удоб­нее использовать тест декапсуляции бактерий. В качестве субстрата в этом случае берут культуры бактерий, в капсульном веществе кото­рых есть гиалуроновая кислота (P. multocida серовар A, S. equi).

На поверхность агара в чашке Петри дробно засевают культуру P. multocida или S. equi. Затем в виде линии высевают на поверх­ность среды культуру микроорганизма, у которого выявляют спо­собность к синтезу гиалуронидазы. Чашки с посевами инкубируют 16...24ч при 37 °С. Если исследуемый микроорганизм выделяет гиалуронидазу, то она диффундирует в толщу питательной среды и разрушает капсулу тест-микроба. При анализе посевов в косо-проходящем пучке света колонии S. equi (P. multocida) вблизи «штриха» исследуемой культуры мелкие, серого или голубого цве­та в отличие от флуоресцирующих отдаленных колоний.

Тест на гемолизин. Бактериальные гемолизины — обширная группа веществ-мембранотоксинов, которые вызывают нарушение целостности мембраны эритроцитов и их лизис.

Исследуемую культуру уколом или дробно засевают в чашки Петри с 5%-м кровяным агаром; посевы инкубируют 24 ч при 37 "С. Гемолизин, выделяемый растущей культурой бактерий, диффундирует в толщу агара и вызывает лизис эритроцитов, что проявляется в виде светлой (бета-гемолиз) или полупрозрачной (альфа-гемолиз) зоны вокруг колоний. Гемолитическую актив­ность микроорганизма можно также определять при посеве в 1...5%-й кровяной бульон, который после культивирования выде­ляющего гемолизин микроба становится прозрачным за счет ли­зиса эритроцитов.

Тест на фибринолизин (стрептокиназу). Многие гемолитические стрептококки образуют стрептокиназу, которая активирует протеолитический фермент плазмы (плазминоген — плазмин), этот фермент —фибринолизин растворяет коагулиро­ванную плазму.

Исследуемую культуру микроорганизма засевают в виде «бляш­ки» на агар с 12% цитрированной плазмы. Посевы инкубируют 23...24ч при 37 °С. Положительный результат —появление зоны просветления вокруг колонии.

Тест на лецитиназу. Лецитиназа расщепляет при гидролизе лецитин. Состав желточного агара: пептон — 20 г, гид­рофосфат натрия —2,5г, натрий—1 г, 0,5%-й раствор сульфата магния —0,1 мл, глюкоза— 1 г, агар— 12,5 г, вода дистиллирован­ная — 500 мл. Устанавливают рН 7,2...7,4, стерилизуют 15 мин при 121 °С, охлаждают до 55 X, добавляют один стерильный желток на 500 мл среды, компоненты перемешивают и смесь разливают в чашки Петри.

Исследуемую культуру засевают дробно; культивируют 24...48 ч при 37...38 "С. Положительный результат —появление зоны по­мутнения вокруг колоний.

Тест на ДНК-азу. Исследуемую культуру бактерий засе­вают «штрихом» на питательный агар с ДНК и культивируют 24 ч при 37 "С. Затем на поверхность среды с бактериальной культу­рой наливают 1н. раствор соляной кислоты. Положительный ре­зультат — при гидролизе ДНК светлая зона вдоль «штриха» куль­туры.

Питательная среда с ДНК: в расплавленный МПА добавляют 10%-й раствор ДНК до конечной 0,2%-й концентрации, переме­шивают компоненты, автоклавируют 15 мин при i 20 "С и разлива­ют в чашки Петри.

Тесты на другие ферменты. Как факторы пато-генности можно рассматривать ферменты, катализирующие реакции с образованием токсических продуктов, например: уреаза гидролизует мочевину с образованием аммиака; декар-

боксилаза декарбоксилирует аминокислоты с образованием аминов и др.

Тест на адгезии ы. В адгезии бактерий принимают участие различные компоненты оболочки. Это свойство выявляют по способности исследуемого микроорганизма сорбироваться на различных эукариотических клетках (эритроциты, энтероциты) или других частицах (латекс). Еще один метод обнаружения адге-зинов связан с их использованием в качестве антигенов в сероло­гических реакциях.

У эшерихий адгезивные свойства часто определяют по их спо­собности агглютинировать эритроциты. В лунки планшетов вно­сят по 50 мкл 4%-й суспензии отмытых эритроцитов морской свинки, 1%-й раствор О-маннозы, суспензию исследуемых бакте­рий с концентрацией клеток 109/мл. Параллельно ставят реакцию в отсутствие маннозы. Результат учитывают через 30...60 мин. По­ложительная реакция— склеивание и оседание эритроцитов в виде «зонтика». Торможение агглютинации маннозой обозначают как маннозочувствительную ГА (гемагглютинация), отсутствие ингибирования — как маннозорезистентную ГА.

Тема 9. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИКИ БАКТЕРИЙ

Генетические механизмы изменчивости бактерий обусловле­ны модификациями, мутациями, рекомбинациями, а также плаз-мидами и умеренными фагами, ДНК которых встраивается в клеточный геном. При этом изменяется один или несколько признаков одновременно в зависимости от числа мутировавших (при мутациях) или приобретенных (при рекомбинациях) генов. Так, например, при S -) R мутации, как правило, изменяются морфология колонии, антигенные и вирулентные свойства бак­терий.

Плазмиды контролируют разнообразные признаки у бактерий: образование бактериоцинов — колицинов (Col-плазмиды), резис-тентность к антибиотикам (R-плазмиды) и многие другие. Коли-цины, образуемые разными сероварами Е. coli, могут отличаться друг от друга по спектру чувствительных к ним бактерий. Метод определения спектра чувствительных к определенному колицину бактерий называется колицинотипированием, а метод определе­ния типа самой Col-плазмиды (Col A, Col В и др.) — колициноге-нотипированием. Данные методы позволяют маркировать бакте­рии одного и того же вида или биовара, что имеет эпизоотическое значение для установления источника инфекции.

R-плазмиды контролируют образование ферментов, разрушаю­щих или модифицирующих разные антибиотики, например бета-лактамаз, разрушающих пенициллины. R-плазмиды благодаря своей трансмиссивности передаются от одних бактерий другим, способствуя тем самым формированию антибиотикорезистентных популяций бактерий.

Индукции мутаций под действием ультрафиолетового излучения

(УФИ). Воздействие УФИ индуцирует у бактерий, в частности Е. coli, предмутационные повреждения и широкий спектр мута­ций, включая замены оснований, образование делений и др.

В качестве источника УФИ используют бактерицидную лампу ВУФ-15, которую устанавливают на расстоянии 60 см от центра облучаемого объекта. Поскольку Е. coli обладает эффективными механизмами световой репарации УФ-поврсждений ДНК, то об­лучение желательно проводить в темноте или при красном свете. Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, на основании которой устанавливают оптимальную мутагенную дозу, равную 0,1... 1 % от числа выживших бактерий.

Для получения lac-мутантов Е. coli испытуемую культуру пред­варительно выращивают в питательном бульоне в течение 14...18 ч. При этом концентрация бактериальных клеток в 1 мл среды составляет примерно 2 ■ 108. Клетки осаждают центрифуги­рованием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 М раствора MgSO4 и охлаж­дают во льду для прекращения деления клеток. Суспензию в объе­ме 50 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в тече­ние 15... 150 с, после чего клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в таком же объеме питательного бульона. Про­бирку с бульонной культурой инкубируют при 37 "С в течение 14...18ч. Затем из разведений 10~3...10~5 по 0,1мл высевают на плотную селективную питательную среду (среда Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.