Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 23 )

Титрационный метод. Производят посев различных объемов воды в глюкозопептонную среду (1%-я пептонная вода, 0,5%-й раствор глюкозы, 0,5 % раствор хлорида натрия, индикатор Анд-рэдз и поплавок), причем для посевов больших объемов (100 и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую 10-кратные количества указанных веществ.

Воду из открытых поверхностных водоемов исследуют в объе­мах 100, 10, 1 и 0,1 мл. Для исследования водопроводной воды де­лают посевы из трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл. Посевы инкубируют в течение суток при 37 "С. О брожении судят по наличию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб производят посевы на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотри-цательных бактерий семейства Psendomonadaceae и других оксида-зоположительных бактерий, обитающих в воде. С этой целью стеклянной палочкой снимают 2...3 изолированные колонии с по­верхности среды, наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-л-фенилендиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положитель­ном — она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин.

Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, вновь исследуют в бродильном тесте — вносят в полужидкий питатель­ный агар с 0,5%-м раствором глюкозы и инкубируют при 37 °С в течение суток. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по статистической таблице 2.

Метод мембранных фильтров. Мембранный фильтр № 3 поме­щают в воронку ЗеЙтца, вмонтированную в колбу Бунзена, кото­рая присоединяется к вакуум~насосу. Мембранные фильтры пред­варительно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Воду из водопроводной сети и воду артезианских скважин фильтруют в объеме 333 мл. Чистую воду открытого водоема фильтруют в объеме 100, 10, 1,0 и 0,1 мл; более загрязненную перед фильтро­ванием разводят стерильной водой. Затем фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 °С в течение суток подсчитывают число выросших колоний, ти­пичных для БГКП.

Из двух-трех колоний красного цвета готовят мазки, окрашива­ют по Граму и ставят оксидазный тест. Для этого фильтр с вырос­шими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не пере­ворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диме-тил-я-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор ок­рашивает колонию в синий цвет. Колонии (2...3), не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5%-м раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37 °С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.

Микрофлора воздуха. Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильтрации.

Седиментационный метод. Две чашки Петри с пи­тательным агаром оставляют в помещении открытыми в течение 5...10 мин, после чего посевы инкубируют в термостате при 37 °С. Ре­зультаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обе­их чашках: менее 250 колоний — воздух считается чистым; 250...500 — загрязненным в средней степени; более 500 колоний — загрязненным.

Аспирационный метод. Наиболее точный количе­ственный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов.

Аппарат Кротова (рис. 43) устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью засасывается через узкую щель плексигласо­вой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорга­низмами равномерно оседают на всю поверхность среды благода­ря постоянному вращению чашки под входной щелью.

Для определения микробного числа воздуха используют питательный агар, для выделения гемолитических стрептокок­ков — кровяной агар с добавлением генци-анового фиолетового с последующим кон­трольным микроскопированием и выбо­рочным пересевом подозрительных коло­ний на кровяной агар.

Состав сред. Кровяной агар с ген-циановым фиолетовым: 2 % питательного агара, 5...10% дефибринированной крови (лошади, кролика или барана) и генциано-вый фиолетовый (1:50 000). Желточно-солевой агар: 2% пита­тельного агара, 10 % хлорида натрия, 20 % (по объему) желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 200 мл изотонического раство­ра хлорида натрия).

Для исследования воздуха служат и другие приборы (Дьякова, Речменского, Киктенко, ПАЕ-1 — пробоотборник аэрозольный бактериологический, ПОВ-1 — прибор для отбора воздуха), в ко­торых определенный объем воздуха пропускается через жидкости или фильтры, а затем делают мерные посевы на питательные сре­ды. Приборами ПАБ-1 и ПОВ-I можно исследовать большие объемы воздуха и обнаруживать патогенные бактерии и вирусы. Воздух микробиологических боксов, хирургических, акушерско-гинекологических и других помещений исследуют с целью обна­ружения патогенных и условно-патогенных бактерий — возбуди­телей инфекций (стафилококки, синегнойные палочки и другие грамотрицательные бактерии).

Микрофлора почвы. При санитарно-микробиологическом ана­лизе почвы определяют микробное число, коли-титр, перфрин-генс-титр и титр термофильных бактерий. В необходимых случаях исследуют состав нитрифицирующих и аммонифицирующих бак­терий, актиномицетов, грибов, целлюлозных и других микроорга­низмов.

Почву для исследования берут на глубине 10...15 см стериль­ным ножом (из разных мест исследуемой территории не менее 10 проб) и помещают в стерильную банку. Из проб готовят навеску (30 г), которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Из полученной суспензии готовят разведения 101, 104, 10s. Из двух последних разведений берут 0,1 мл и смешивают с 40 мл 0,7%-го расплавленного и остуженного до 45 °С питательного ага­ра, после чего выливают вторым слоем в чашки Петри с 2%-м пи­тательным агаром. Посевы инкубируют при 37 X. Затем подсчи­тывают число выросших колоний и определяют микробное число.

Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий п о - ч в ы. Различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера и инкубируют при 43 °С в те­чение 48 ч. В дальнейшем анализ проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра воды.

Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии (1 мл) засевают в пробирки со стерильным обезжиренным молоком или железосульфитной средой Вильсо­на—Блера, приготовленной ex tempore. Посевы инкубируют при 43 °С в течение 24...48 ч, после чего учитывают результаты по свер­тыванию молока или по образованию черных колоний Clostridium peifringens в агаровом столбике среды Вильсона—Блера. Из коло­ний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и вы­числяют перфрингенс-титр.

Для определения титра термофильных бактерий разведения по­чвенной суспензии {1 мл) вносят в чашки Петри, заливают рас­плавленным и охлажденным питательным агаром. Посевы инку­бируют в течение суток при 60 °С, а затем подсчитывают число выросших колоний и пересчитывают на 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическую оценку почвы производят по комплексу показателей, из которых наиболее важным является ус­тановление степени фекального загрязнения.

Состав сред. Среда Кесслера: 1 % пептона, 5 % желчи, 0,25 % лактозы, генциановый фиолетовый для подавления роста грам положительных бактерий. Железосульфитная среда Вильсона — Блера: 3 % питательного агара, 1 % глюкозы, 2 % сульфита натрия, 0,08 % хлорида железа.

Санитарно-бактериологическое исследование молока и молочных продуктов.

Санитарно-бактериологическое состояние молока и молочных продуктов оценивают по микробному числу и коли-титру.

Для определения микробного числа молоко разводят стериль­ным изотоническим раствором хлорида натрия (1 : 10; 1 : 100; 1: 1000); каждое разведение (1 мл) выливают на дно стерильных чашек Петри, заливают расплавленным и остуженным агаром. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего подсчи­тывают число выросших колоний.

Для определения коли-титра молоко засевают в 6 пробирок со средой Кесслера: в 3 пробирки вносят по 1 мл молока, а в осталь­ные 3 — по 0,1 мл молока (1 мл молока разводят в 10 раз стерильной водой). Посевы инкубируют при 43 °С в течение суток, после чего из забродивших проб делают посевы на среду Эндо и инкуби­руют при 37 °С. Из выросших колоний красного цвета готовят мазки (окрашивают по Граму, микроскопируют) и делают посев на среду Козера, а также в пептонную воду с 1 % глюкозы. Про­бирки с посевами на среде Козера инкубируют при 37 X, а на сре­де с глюкозой — при 43 °С в течение суток. При оценке результа­тов учитывают только бактерии, вызывающие брожение глюкозы с образованием кислоты и газа, но не дающие роста на нитратной среде Козера.

Среда Козера: дистиллированная вода, 0,15% фосфата натрий аммония, 0,1 % фосфата калия однозамещенного, 0,02 % сульфата магния, 0,25 % цитрата натрия.

Аналогичным образом исследуют сливки, молочнокислые про­дукты. Определяют величину коли-титра и проводят оценку про­дукта в соответствии с нормативами.

Для обнаружения в молоке патогенных бактерий делают посе­вы на соответствующие элективные и дифференциально-диагнос­тические среды с последующим выделением чистых культур и их идентификацией.

Санитарно-бактернологическое исследование мяса, колбасных изделий к мясных продуктов.

При микроскопическом исследова­нии мяса определяют число бактерий в мазках-отпечатках, кото­рые готовят из кусочков мяса размером 2 х 1,5 х 2,5 см. Мазки ок­рашивают по Граму и микроскопируют. Мясо считается свежим, если в поле зрения обнаружено не более 10 бактериальных клеток.

Бактериологическое исследование колбасных изделий и мяс­ных продуктов согласно ГОСТам включает в себя определение микробного числа, а также БГКП, сальмонелл, бактерий рода Proteus, коагулазоположительных стафилококков, листерий и сульфитредуцирующих клостридий.

Анализ проводят не позднее чем через 4 ч с момента отбора проб, которые берут с поверхностных и глубинных участков про­дукта. При исследовании глубинных участков образцы продукта предварительно обрабатывают спиртом и обжигают. К навескам продукта массой 20 г добавляют 80 мл стерильного изотоническо­го раствора хлорида натрия и гомогенизируют в электрическом смесителе.