Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 4 )

4.  Зеркало устанавливают плоской поверхностью и почти полстью закрывают диафрагму осветителя.

5.  На зеркало помещают лист белой бумаги и, передвигая пат­рон осветителя, добиваются четкого изображения на бумаге его нити накала лампы.

6.  Глядя в окуляр, при помощи зеркала получают в центре поля зрения изображение краев диафрагмы осветителя — светлое пятно с нерезко очерченными краями.

7.  Используя объектив х8, фокусируют объект в области свет­ лого пятна.

8.  Опуская конденсор, в плоскости препарата фокусируют изображение краев диафрагмы осветителя и движением зеркала переводят светлое пятно в центр поля зрения.

9.  Диафрагму осветителя открывают до тех пор, пока светлое пятно не закроет все поле зрения.

10. В дальнейшем положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не меняют.

0 5 10 15 20 25

0 12 3 4 5 6

- Окуляр-микрометр • Объект-микрометр

Рис. 6. Определение цены деления окуляр-микрометра.

При работе с учебным микроскопом освещение нередко устанавливают уп­рощенным способом. При­ступая к работе, следует проверить состояние кон­денсора: он должен быть приподнят, диафрагма открыта.
Приподняв тубус микроскопа, устанавливают объектив с наименьшим увеличением (х8, хЮ) и, глядя в окуляр, при помощи зеркала добиваются полно­го освещения поля зрения. На исследуемый препарат наносят кап­лю кедрового масла (или его заменителя), помещают препарат на предметный столик и поворотом револьвера устанавливают иммер­сионный объектив. (Чтобы избежать соприкосновения объектива со столиком, тубус следует держать приподнятым.) Под контролем глаза (смотреть сбоку) фронтальную линзу объектива легким пово­ротом макрометрического винта погружают в каплю иммерсионно­го масла и, наблюдая в окуляр, осторожно поднимают тубус до ви­димости препарата. Затем легкими поворотами микрометрического винта (вперед-назад) регулируют четкость изображения.

Световая микроскопия.

Существует несколько модификаций светового микроскопа, позволяющих изучать детали строения микроскопических объектов.

Бактериальные и другие биологические препараты в большин­стве своем прозрачны в видимом свете. Лучи света, прошедшие через подобные объекты, почти неотличимы от лучей, прошедших через окружающую их среду. Поэтому при микроскопировании важное значение имеет освещение исследуемого объекта.

Чтобы исследовать под микроскопом живые нефиксированные неокрашенные микроорганизмы, используют особые оптические си­стемы: фазово-контрастное устройство и темнопольный конденсор.

Фазово-контрастное устройство

(рис. 7)обеспечивает четкое изображение объектов. В основе этого метода ле­жит изменение фазы световых лучей при прохождении их через прозрачные объекты. Как известно, человеческий глаз выявляет только различия в длине (цвет) и амплитуде (интенсивности) све­товой волны, но не в состоянии выявить различия в фазе. С помо­щью фазово-контрастного устройства различия в фазе превраща­ются в изменение амплитуды, в результате чего прозрачные объекты становятся видимыми человеческим глазом.

Другое полезное приспособление в микроскопии — специ­альный конденсор, создающий эффект так называемого темного поля. Темнопольный конденсор отличается от обычного тем, что пропускает только косые краевые лучи источника света, которые ввиду их сильного наклона не попадают в объектив, в ре­зультате чего поле зрения микроскопа остается темным.

Косые лучи, пропускаемые конденсором, проходят через пре­парат, содержащий частицы разной оптической плотности, огиба­ют их, образуя волны дифрагированного света. В результате этого получается чрезвычайно контрастный препарат, на темном фоне которого видны окруженные сиянием плотные частички, напри­мер клетки бактерий (рис. 8).

Фазово-контрастное устройство включает в себя фазовую плас­тинку— расположенный в задней фокальной плоскости объекти­ва прозрачный диск, на поверхность которого напылено кольцо из

. 7. Схема фазово-контрастного устройства:

I — кольцевая диафрагма; 2 — конденсор; 3 — объект; ^—объектив; 5 —фазовая пластинка

металла (фазовое кольцо); кольцевую диафрагму — помещенную под конден­сором светонепроницаемую пластину с прозрачным кольцевидным участком.

Световая волна при прохождении через живую клетку отстает по фазе Приблизительно на '/4 Длины волны и дополнительно сдвигается еще на 'Д после прохождения через фазовую пла­стинку (см. рис. 7). Сдвинутые по фазе после прохождения через фазовую пла­стинку лучи либо совпадают и сливают­ся с прямыми лучами, идущими мимо объекта, либо оказываются в противо-фазе. В первом случае исследуемый объект виден как светлый на темном фоне, а во втором — как темный на светлом фоне. В мик­робиологии широко применяют фазово-контрастное устройство КФ-4 (см. рис. 7) (объект виден темным на светлом фоне).

Работа с фазово-контрастным устройством:

1. Обычный конденсор заменяют на фазово-контрастный, а объектив х40 — на аналогичный фазовый объектив.

2.  Диск револьвера конденсора поворачивают до появления в окошечке цифры 0; диафрагму конденсора полностью открывают.

3.  Используя объектив х8, устанавливают освещение по Келеру.

4.  Обычный окуляр заменяют на вспомогательный и с помо­щью тубуса добиваются четкого изображения фазовой пластинки в виде темного кольца.

5. Устанавливают кольцевую диафрагму, соответствующую объективу х40. В этом случае наряду с темным кольцом фазовой ластинки можно видеть свет­лое кольцо диафрагмы.

6. При помощи центрировоч-ных винтов совмещают фазовое кольцо и кольцо диафрагмы.

Рис. 8. Ход лучей в темнолольных конденсорах:

а — параболоид- конденсор; 6~ кардиоид-конденсор; / — объектив; 2—иммерсионное масло; 3 — пренарат; ^ — зеркальная поверх­ность; 5 —диафрагма

; 2

20

Рис. 9. Оптическая схема люминесцентного микроскопа:

/ —ртутно-кварцевая лампа; 2— коллектор; 3 — кювета; 4—сменные светофильтры; 5— апергурная диафрагма; 6, 8— собирательные линзы; 7— полевая диафрагма; 9— светоотдели-тельная пластинка; 10— объектив; 11 — объект; 12— запирающий светофильтр (сменный); О —зеркало; 14— окуляр; /5— фотоокуляр (гомал); 16— фотопленка; 17— тепловые лучи лампы; i#— УФ-лучи; 19 — сине-фиолетовые лучи; 20—лучи люминесценции.

7. Вспомогательный окуляр заменяют обычным и микроско-пируют препарат. При работе с другими объективами устанавли­вают соответствующие диафрагмы.

Темнопольный конденсор.

При темнопольной микроскопии используют специальный конденсор с затемненной центральной частью, поэтому в плоскость объекта попадают толь­ко боковые лучи, отраженные от внутренних зеркальных поверх­ностей конденсора. Лучи направлены под таким углом, что не по­падают в линзу объектива, и поэтому поле зрения выглядит тем­ным (см. рис. 8). Та часть лучей, которая попадает на объект, отра­жается в линзу объектива, что позволяет видеть светлое изображение объекта на темном фоне.

Метод темнопольной микроскопии:

1.  Вынимают окуляр, светлопольный конденсор и вывинчивают один из объективов (х8).

2.  Прикрывают диафрагму осветителя и фокусируют нить накала лампы осветителя на листе белой бумаги, помещенном на зеркало (см. п. 5 установки освещения по Келеру).

3.  Раскрывают диафрагму осветителя, закрывают матовым стеклом конец тубуса и с помощью зеркала добиваются равномерого освещения поля зрения.

4.  Ставят на место окуляр, объектив х8, темнопольный конденсор, положение зеркала при этом не изменяют.

5.  На линзу конденсора наносят каплю дистиллированной воды, на столик помещают препарат «раздавленная капля» таким образом, чтобы вода на линзе конденсора контактировала с нижней поверхностью предметного стекла.

6.  Глядя в окуляр, при помощи центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое кольцо с темным пятном в центре. Далее регулируют видимость объекта в поле зрения.

Люминесцентная микроскопия.

Люминесценцией (lumen — свет, escent — слабое действие) называется свечение объекта, возбуждае­мое поглощенной им световой энергией. Возбуждать люминесцен­цию можно как ультрафиолетовым излучением, так и коротковол­новым излучением видимой части спектра — сине-фиолетовым. При этом может возникать люминесценция в цветовой гамме види­мого спектра, что дает цветное светящееся изображение. Если объект сам не дает явления люминесценции, его подкрашивают специальными красителями — флуорохромами (акридин оранже­вый, корифосфин, тиофлавин и др.).

Установка для люминесцентной микроскопии в видимых лучах состоит из яркого источника света и биологического микроскопа (рис. 9). Непосредственно между источником света и зеркалом микроскопа устанавливают сине-фиолетовый светофильтр, а на окуляр микроскопа — желтый светофильтр. Сине-фиолетовый свет, попав на препарат, возбуждает в последнем люминесцен­цию. Для того чтобы ее увидеть, необходимо убрать все сине-фиолетовые лучи, что и осуществляет желтый фильтр на окуляре, от­секающий коротковолновую часть спектра и пропускающий в глаз наблюдателя длинноволновый свет флуоресценции.

Ветеринарно-бактериологические лаборатории снабжены лю­минесцентными микроскопами серий МЛ и «Люмам» (Р-1, Р-2, Р-3 — модели рабочего типа; И-1, И-2, И-3 — модели исследова­тельского типа).

Атомы некоторых веществ, называемых люминофорами (люми-ногены, флуорохромы), поглощая энергию, переходят на более высокий энергетический уровень (возбуждаются). Возбужденное состояние слабоустойчивое, атомы возвращаются на стабильный низкоэнергетический уровень, отдавая избыток энергии в виде свечения — люминесценции. В зависимости от источника энергии возбуждения различают фото-, электро-, радио-, хемо - и рентге-нолюми несценцию.