Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 26 )

Разведения удобно производить следующим образом. В отдель­ной пробирке готовят основное (исходное) разведение сыворот­ки — 1: 25, смешивая 0,1 мл испытуемой сыворотки с добавлени­ем 2,4 мл физиологического раствора. В опытные пробирки разли­вают по 1 мл физиологического раствора. Затем из исходного раз­ведения 1 мл жидкости переносят в первую опытную пробирку, смешивают с физраствором (разведение 1: 50) и 1 мл переносят во вторую пробирку (1: 100), из второй 1 мл — в третью и т. д. Из последней пробирки 1 мл выливают в сливную чашку, чтобы в каждой пробирке осталось по 1 мл разведенной сыворотки (рис. 44).

Во все пробирки добавляют по две капли стандартного антиге­на (концентрация 10 млрд микробных тел в 1мл), смешивают встряхиванием и выдерживают в термостате 4...6 ч при 37 °С, а за­тем при комнатной температуре 14...16 ч.

При постановке РА (как при каждой серологической реакции) обязательны контроли: в тех же разведениях испытывают сыво­ротку нормальную (от здорового животного) и позитивную (от за­ведомо больного животного или стандартную биофабричного про­изводства) с тем же антигеном.

Компоненты при постановке реакции вносят в пробирки индивидуальными мерными пипетками с резиновыми груша­ми или дозаторами, групповыми дозаторами (рис. 45...47) и автоматическими пипетками с изменяющимися объемами (5...25Омкл).

Рис. 45. Многоканальные пипетки для мнкротнтровання: / —оБший вид; 2. а, б, в, г — последовательность работы

Рис. 46. Одиночная автоматическая пипетка:

/ — стеклянный патрубок; 7—расшире­ние для сбора избыточной жидкости; J — резиновая груша; 4 — пипетка-мерник

Рис. 47. Групповая автоматическая пипетка:

/ — стеклянный цилиндр; 2 — отверстие для слива избыточной жидкости; 3— приемник для избыточной жидкости; 4 —отверстия нижней части цилиндра; 5— пипетки-мерни­ки; 6— резиновая груша

Для контроля антигена в 1 мл физиологического раствора до­бавляют две капли антигена для исключения самоагглютинации.

Учет РА осуществляют невооруженным глазом или с помощью агглюти носко па, начиная с контрольных пробирок. Результат РА принято выражать количеством крестов:

++++ (#) —полное просветление жидкости; образовавшийся агглютинат имеет вид перевернутого зонтика, при встряхивании разбивается в глыбки, хлопья разной величины, жидкость остается прозрачной;

+ + +(///) — неполное просветление жидкости; агглютинат, как и в предыдущем опыте, в виде зонтика, при встряхивании раз­бивается на более мелкие глыбки, комочки;

++(++) — неполное просветление жидкости; агглютинат в виде зонтика, но при встряхивании разбивается на хлопья разной величины, жидкость мутная;

+ — наличие небольшого нехарактерного осадка в виде «пугов­ки», жидкость над ним мутная. При встряхивании такой осадок легко разбивается, увеличивая мутность;

— (минус) — вся жидкость мутная, на дне пробирки небольшой осадок антигена с ровными краями в виде «пуговки» и при встря­хивании разбивается в равномерную муть.

РА в 3...4 креста учитывается как положительная степень прояв­ления агглютинации, в два креста — сомнительная, один крест или отсутствие агтлютината — выражает отрицательный результат. Ре­акцию оценивают не только по степени выраженности (++ + +, + + + или + +), но и по высоте титров, то есть степени разведения сывороток, давших положительный результат РА. Например, для ди­агностики бруцеллеза крупных животных диагностическим титром считают положительный результат РА с сывороткой в разведении не ниже 1:100, при сальмонеллезном аборте кобыл — выше 1 : 500.

Капельный (пластинчатый) метод РА. Ис­пользуют для быстрого обследования поголовья животных в лабо­ратории и в условиях хозяйства. На чистую стеклянную пластинку наносят микропипеткой исследуемую сыворотку по 0,04; 0,02; 0,01 и 0,005 мл. К каждой сыворотке добавляют по одной капле антигена определенной концентрации, постепенно смешивают чистой стеклянной палочкой, начиная с наименьшего объема сы­воротки. Условно считают, что сыворотка в первой капле соответ­ствует разведению 1: 50, во второй — 1:100, в третьей — 1: 200, в четвертой — 1: 400. Через 2...3 мин производят учет. Для ускоре­ния реакции стекло слегка подогревают, держа высоко над пламе­нем горелки.

Положительный результат проявляется образованием в капле сыворотки комплекса антиген — антитело в виде крупинок, хло­пьев и просветлением жидкости. При отрицательном результате капля смеси сыворотки и антигена остается равномерно мутной (отсутствие в сыворотке антител).

Пластинчатым методом РА пользуются также для ориентиро­вочного определения вида микроба или его идентификации (ти­пизации). На предметное стекло наносят каплю известной специ­фической сыворотки и отдельно каплю физраствора (для контро­ля). В каждую каплю добавляют культуру испытуемого микроба в количестве, взятом бактериологической петлей, и равномерно размешивают. Положительная реакция указывает на гомологич-ность антигена с известным антителом.

Кровяно-капельный метод РА. Реакцию чаще применяют для диагностики пуллороза (сальмонеллеза птиц) и бруцеллеза. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю цельной крови (взятой у птиц из гребешка или сережки), в нее добавляют каплю соответствующего антигена и смешивают стек­лянной палочкой. Для лучшей видимости феномена агглютина­ции биопромышленность выпускает антиген, подкрашенный ге­матоксилином.

В положительных случаях РА (когда в крови присутствуют спе­цифические антигену антитела) через 30...60 с в капле смеси появ­ляются глыбки, хлопья склеенного антигена (агглютинат).

Кольцевая проба (реакция) с молоком. В основном используют при обследовании крупного рогатого скота на бруцеллез и при контроле сборного молока. В агглютинацион-ные пробирки наливают по 2...3 мл свежего цельного молока и до­бавляют антиген (окрашенный гематоксилином) по 0,2 мл (2 кап­ли). Пробирки встряхивают до равномерного окрашивания моло­ка, выдерживают в водяной бане (или термостате) при 37 °С в те­чение 45.60 мин. При наличии в молоке антител образуется комплекс антиген—антитело, который адсорбируется на капель­ках жира и при отстаивании всплывает наверх, образуя синее кольцо в нижнем слое сливок; столбик молока обесцвечивается.

Отрицательная реакция характеризуется синей окраской всего мо­лока в пробирке и слегка желтоватым слоем сливок.

РА методом адсорбции антител (по Кас­те л л а н и). У некоторых микробов наряду со специфическими видовыми антигенами имеются еще групповые, общие с другими видами одного рода или семейства бактерий. При введении в орга­низм животного (и человека) таких бактерий (например, сальмо­нелл) образуются антитела как против видоспецифических, так и групповых (общих для разных видов) антигенов. Если в реакции участвует микроб, обладающий групповым и типовым антигенами, то происходит полная агглютинация общих (групповых) и тииоспе-цифических антигенов, при этом из сыворотки все антитела адсор­бируются. Если антиген не типоспецифичен антителам, происхо­дит реакция агглютинации за счет групповых антигенов и группо­вых антител, типоспецифические антитела в сыворотке остаются.

Адсорбированные групповые антитела удаляют; сыворотки с групповым агглютинатом центрифугируют, а надосадочную жид­кость (сыворотку с оставшимися типоспецифическими антитела­ми) отсасывают и вновь используют в РА. Так как сыворотка, ис­тощенная групповыми антигенами, содержит только специфичес­кие антитела, она будет реагировать положительно лишь со спе­цифическим антигеном. На этом принципе основан метод' получения монорецепторных сывороток.

Реакция Кумбса. В ряде случаев при постановке РА выпадения агглютината не происходит. Одной из причин этого является наличие в сыворотке больных животных наряду с полны­ми антителами так называемых неполных или блокирующих анти­тел, которые тормозят образование агглютината (выпадение комп­лекса антиген—антитело в виде осадка). Методика выявления не­полных антител в организме больного разработана Кумбсом.

Прямая реакция Кумбса (рис. 48) заключается в том, что к эрит­роцитам больного животного добавляют специфическую антигло-булиновую сыворотку (содержащую антитела против глобулинов сыворотки). Эритроциты агглютинируют. При непрямой реакции исследуют сыворотку больного, которую соединяют с эритроцита­ми здорового животного, затем, как и при прямом методе, добав­ляют антиглобулиновую сыворотку. Блокирующие (неполные) ан­титела соединяются с эритроцитами, и добавленная антиглобули-новая сыворотка, вступая в реакцию с неполными антителами, приводит к агглютинации эритроцитов, нагруженных неполными антителами.

Для диагностических целей в ветеринарии разработана удобная модификация методики реакции Кумбса — бактерийный вариант, в котором вместо эритроцитов применяют специфический бакте­рийный антиген.

Бактерийный вариант реакции Кумбса. С исследуемыми сыво­ротками ставят обычную РА. После учета результата реакции в пробирки, в которых отсутствует агглютинация, добавляют по 2 мл физраствора и центрифугируют при 4000 мин~' в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют 1 мл антиглобулиновой сыворотки в рабочем титре (установлен пред­варительно). Центрифужные пробирки встряхивают, содержимое переносят в агглютинационные пробирки, ставят их в термостат при 37...38 °С на 16...48 ч, а затем выдерживают еще 1 ч при ком­натной температуре. Учет производят по характеру агглютината, как при обычном методе РА. Реакция Кумбса очень чувствитель­ная и позволяет более точно выявлять больных.

Реакция гемагглютинации (РГ А). Основана на том, что некоторые виды бактерий и вирусов обладают способнос­тью адсорбироваться на поверхности эритроцитов разных видов животных (и птиц), вызывая их склеивание и образование агглю­тината (прямая РГА).