Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 5 )

В лабораторной практике в основном используют фотолюми­несценцию — свечение, возбуждаемое энергией световых лучей. По длительности свечения различают люминесценцию кратковре­менную — флуоресценцию, быстро затухающую после прекращения воздействия возбуждающих лучей, и длительную — фосфоресцен­цию, продолжающуюся и после окончания возбуждения вещества. По правилу Стокса свет флуоресценции отличается от света воз­буждения большей длиной волны, поэтому при освещении объек­та невидимыми ультрафиолетовыми или короткими сине-фиоле­товыми лучами получают длинноволновые свечения объектов, хо­рошо видимые простым глазом.

Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первич­ная люминесценция присуща практически всем веществам, однако интенсивность свечения большинства из них невелика. Флуорох-ромы, связываясь с определенными химическими структурами клетки, придают им способность ярко люминесцировать при ос­вещении объекта (препарата) сине-фиолетовыми лучами — вто­ричная люминесценция.

В люминесцентных микроскопах источником возбуждения служит ртутно-кварцевая лампа ДРТ-250. Для успешной люми­несцентной микроскопии необходимо: 1) из светового потока, идущего от ртутно-кварцевой лампы, с помощью специальных светофильтров выделить коротковолновую (сине-фиолетовую) часть спектра для возбуждения свечения изучаемого объекта и от­сечь лучи той же длины, что и лучи люминесценции (в противном случае все поле зрения будет интенсивно светиться). Для этого между источником света и исследуемым объектом ставят свето­фильтры (возбуждающие) УФС-3, ФС-1, СС-4 и др.; 2) из свето-воТо потока, идущего от изучаемого объекта в окуляр, пропустить длинноволновое свечение (люминесценцию) и одновременно за­щитить глаз наблюдателя от коротковолновых (возбуждающих) лучей. С этой целью между объектом и глазом наблюдателя по­мешают окулярные (запирающие) светофильтры: ЖС-3, ЖС-18, Т-1НиТ-2Н.

Сочетанное применение в оптической системе люминесцентного микроскола фильтров целевого назначения (возбуждающие, запира­ющие) называют принципом скрещенных фильтров. Эффект скрещен­ных светофильтров обеспечивает цветную (зелено-желтую) флуорес­ценцию объектов на темном фоне поля зрения. Ход лучей в люми­несцентном микроскопе показан на рисунке 9. Лучи от лампы ДРТ попадают на светоделительную пластинку между объективом и оку­ляром. Ненужные длинноволновые лучи проходят через светодели­тельную пластинку и гаснут в кожухе микроскопа. Возбуждающие коротковолновые лучи пластинка отражает на изучаемый объект. Часть возбуждающих лучей трансформируется на объекте в длинно­волновые лучи люминесценции, которые проходят через объектив, светоделительную пластинку, запирающие фильтры и попадают в глаз наблюдателя. Другую часть возбуждающих лучей, не претерпев­ших изменений, светоделительная пластинка отражает в сторону ис­точника света. Такое дифференцирующее свойство светоделитель-ной пластинки обусловлено тем, что она покрыта несколькими слоя­ми диэлектриков и расположена под углом 45° по отношению к па­дающим на нее лучам.

Существенное отличие микроскопов серии «Люам» т МЛ — наличие у «Люмам» сменных светоделительных пластин с разны­ми параметрами возбуждающего спектра и спектра люминесцен­ции, комбинируемых с соответствующими запирающими фильт­рами и фильтрами возбуждающего света. При люминесцентной мик­роскопии в качестве иммерси­онной жидкости используют специальное нефлуоресцирую-щее масло (обычное иммерси­онное масло для этих целей не­пригодно из-за собственной люминесценции).

Преимущество люминесцентной микроскопии заклю­чается В ТОМ, ЧТО она дает цветное изображение, высокую сте-пень контрастности, возможность обнаруживать в исследуемом материале бактерии в небольших количествах (цв. рис. I; рис.10). В микробиологии нашли применение такие виды исследований, как люминесцентная микроскопия флюорохромированных объектов и метод флуоресциру-ющих-антител (МФА) в экспресс-диагностике инфекционных болезней.

Люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить ряд важ­ных клеточных структур, изучить их изменения при разных функ­циональных состояниях организма, различать мертвые и живые клетки, облегчает количественный подсчет микроорганизмов.

Для люминесцентной микроскопии применяют осветитель ОИ-18 с ртутно-кварцевой лампой РК или СВДШ-120А в комби­нации с обычными биологическими микроскопами, или специ­альный люминесцентный микроскоп МЛ-2.

Рис.10 Вид препарата в люминесцентном микроскопе.

Рис. 11. Схема электронного микроскопа:

/ — к вакууму; 2— вакуумная трубка; J—к ис­точнику питания нити накала; 4— нить (катод); 5—анод; 6 — заземление; 7— электронный луч; 8— конденсорная линза; 9— объект; 10— объек­тивная линза; 11 — увеличенное изображение объекта; 12 — проекционная линза; 13 — люми­несцентный экран; 14 — фотографическая плас­тинка; /5— к источнику питания линз. То­чечной линией изображен ход электрон­ных лучей

Электронная микроскопия.

Появление электронного микроско­па стало новым этапом в развитии микроскопии благодаря повы­шению разрешающей способности по меньшей мере в 100 раз из-за использования вместо света потока движущихся электронов.

Электронный микроскоп (рис. 11) является своеобразной ко­пией светового микроскопа (по принципу устройства). Как и в световом микроскопе, в электронном микроскопе освещение обеспечивает источник света, формирующий изображение. Ин­тенсивность и собирание лучей осуществляются с помошью кон-денсорной линзы. Конечное изображение производит проекцион­ная линза в электронном микроскопе или окуляр в световом мик­роскопе. Основное различие между световым и электронным мик­роскопами заключается в том, что в качестве источника освещения для получения изображения в электронном микроско­пе1, служит электронный пучок, а вместо стеклянных линз —маг­нитные или электростатические поля. В световом микроскопе изображение воспринимается глазом непосредственно, а в элект­ронном оно видимо только на флуоресцирующем экране. Изобра­жения в электронном микроскопе можно получить на фотоплас­тинке, помещаемой под экраном.

Электронный микроскоп обес­печивает возможность эффектив­ного визуального наблюдения и анализа структуры твердых тел неоднородного характера от 0,01 нм и менее до 10 нм.

Длина волн видимой области спектра лежит в пределах 0,4...0,7 мкм, следовательно, мак­симальное разрешение (половина длины волны), которое можно получить при помощи светового микроскопа, — около 0,2 мкм (200 нм). Волновые свойства также присущи электронам. При на­пряжениях 50... 100 тыс. В длина волны электрона составляет 0,0055... 0,0039 нм. По чисто техническим причинам получить тео­ретически максимальное разрешение, равное 0,002 нм, невозмож­но, и на практике оно не превышает 1...2 нм.

Основная часть электронного микроскопа включает в себя ряд магнитных линз, люминесцентный экран и фотографическую пластинку. Электрический ток проходит через вольфрамовую нить и вызывает эмиссию электронов. К нити приложено высокое отрицательное напряжение, что обеспечивает большую разницу потенциалов между нитью и заземленной пластиной анода. В этом поле электроны движутся к аноду, часть из них проходит че­рез отверстие в центре анода (центральная апертура) и формирует электронный луч, который фокусируется первой магнитной лин­зой (конденсорной) и освещает объект. Большая часть электронов проходит через объект без отклонения, часть электронов после столкновения с тяжелыми атомами выбивается из общего элект­ронного луча. В итоге образуется такая структура электронного луча, которая при дополнительной фокусировке дает изображение объекта.

Электроны, прошедшие через объект, фокусируются объектив­ной магнитной линзой, которая дает увеличенное изображение; третья магнитная линза (проекционная), в свою очередь, также увеличивает изображение, которое и попадает на экран. Если лю­минесцентный экран убрать, то луч попадает на фотопластинку.

Электронный микроскоп, создающий изображение при прохож­дении электронов через тонкопленочный образец, называют транс­миссионным или просвечивающим. В сканирующем электронном микроскопе первичный электронный луч, попадая на поверхность фиксированного, высушенного и покрытого тонким слоем металла объекта, вызывает различные вторичные излучения, интенсивность которых зависит от характеристик рельефа, электропроводности и химического состава. Полезное увеличение сканирующей элект­ронной микроскопии обычно не превышает 50 тыс. раз. С ее помо­щью получают трехмерное изображение изучаемого объекта.

Тема 2. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

2.1. ФОРМА БАКТЕРИЙ

Морфология бактерий. Микроорганизмы имеют разнообразную форму и довольно сложную структуру, определяющую многообра­зие их функциональной деятельности. Для бактерий характерны четыре основные формы: сферическая (кокковая шаровидная), цилиндрическая (палочковидная), извитая и нитевидная (рис. 12).

Шаровидные бактерии — кокки — в зависимости от плоскости делений и расположения относительно друг друга от­дельных особей подразделяют на монококки (отдельно лежащие кокки), диплококки (парные кокки), стрептококки (цепочки кок­ков), стафилококки (скопления в виде виноградных гроздьев), тетракокки (образования из четырех кокков) и сарцины (скопле­ния в виде пакетов из 8 или 16 кокков).

Палочковидные бактерии располагаются в виде оди­ночных клеток, дишто - или стрептобактерий. Ряд бактерий обра­зуют споры, которые располагаются терминально, субтерминаль­но или центрально; превышая поперечный размер клетки, споры придают ей веретенообразную форму. В зависимости от наличия и расположения в теле бактерии спор различают: бактерии, бацил­лы, клостридии и плектридии.

Извитые формы бактерий — вибрионы, спириллы и спи­рохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых палочек, спирил­лы — извитую форму с крупными и мелкими завитками.