Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 33 )

Плазмокоагулазную активность определяют в специальной ре­акции — плазмокоагуляции (РПК). Для постановки ее необходи­мы молодые культуры стафилококков; для контроля — заведомо коагулирующий и некоагулирующий штаммы микробов, нативная или сухая нитратная плазма кролика.

Кровь берут из сердца кролика массой 1,5...2 кг, зафиксирован­ного в спинном положении, в объеме 8 мл иглой, надетой на шприц, промытый 5 %-м раствором цитрата натрия. Ее осторожно сливают в пробирку с 2 мл 5 %-го раствора цитрата натрия и осто­рожно перемешивают. Кролику же вводят подкожно 8 мл стериль­ного физиологического раствора. Пробирку с кровью выдерживают при 4 °С до осаждения эритроцитов. Для ускорения процесса цит-ратную кровь можно центрифугировать при оборотах 1500...2000 мин-1. Надосадочная жидкость —это и есть плазма. Срок ее годности при хранении в холодильнике составляет 4...5 сут.

Перед постановкой РПК отсасывают необходимое количество плазмы, разводят ее физиологическим раствором 1 : 5, разливают в пробирки по 0,5 мл и вносят в них по 0,5 мл бульонной культуры. При исследовании культур, выращенных на плотной среде, плаз­му разводят 1:10, разливают в пробирки по ] мл и диспергируют в ней 1 петлю агаровой культуры стафилококка. В обоих случаях пробирки встряхивают и помешают в термостат при 37 "С. Учиты­вают результат через 1, 2, 3 и 24 ч. Наличие плотного или желеоб­разного сгустка указывает на положительный результат реакции. Для признания штамма патогенным срок наступления реакции не имеет значения.

Для выявления фибринолитической способности стафилококков пробирки с положительными результатами плазмокоагулирования оставляют в термостате на несколько суток. При наличии фибри-нолизина коагулированная плазма разжижается.

Способность стафилококков продуцировать лецитиназу опреде­ляют разными методами. Наиболее доступен из них следующий: к расплавленному и остуженному до 5О...6О°С М ПА добавляют взби­тые яичные желтки, хорошо размешивают их и выливают в чашки Петри. После застывания (затвердения) среды производят посев испытуемых культур. При росте на этой среде лецитиназоположи­тельные штаммы стафилококков через 24...48 ч образуют вокруг ко­лонии зону помутнения, окруженную радужным венчиком.

Скрытую (потенциальную) гемолитическую способность стафи­лококков выявляют на 5 %-м кровяном МПА. Для этого бактерио­логической петлей по диаметру чашки делают прямой полоской посев бета-гемолитического штамма стафилококка. Затем перпен­дикулярно этой полоске с двух сторон высевают по 4...5 испытуе­мых штаммов стафилококков. После суточного инкубирования при 37 "С некоторые негемолитические штаммы в непосредственной близости к: высеянному по диаметру р"-гемолитическому штамму стафилококка образуют зону четко выраженного гемолиза.

Для определения ДНК-азной активности стафилококков необ­ходимо иметь МПА с рН 8,4...8,6, раствор натриевой соли ДНК (20 мг/мл) в стерильной дистиллированной воде, к которому до­бавлено несколько капель 2 %-го натрия гидроксида (можно хра­нить при 4 "С до 40сут), хлорид кальция (раствор, используемый для инъекций), 1н. раствор соляной кислоты.

К расплавленному и несколько охлажденному МПАдобавляют раствор натриевой соли ДНК из расчета 1... 1,5 мг/мл и стерилизу­ют в водяной бане кипячением 30...40 мин. После охлаждения сре­ды до 5О...6О°С к ней асептично добавляют хлорид кальция из рас­чета 0,8 мг/мл, разливают в чашки Петри по 10... 15 мл. На поверх­ность застывшей среды после ее подсушивания высевают прикос­новением петли в заранее размеченные точки 8...10 испытуемых культур стафилококка и инкубируют 18...20ч при 37 "С. Затем в чашку вносят 4...5 млн 1н. раствора соляной кислоты, которую че­рез 2...3 мин сливают. Результат реакции учитывают, просматри­вая чашки на проходящем рассеянном свете. По наличию просве­чивающих зон вокруг колоний на непрозрачном, мутном серо-бе­лом фоне всего слоя агара делают вывод — культура стафилококка продуцирует ДНК-азу.

Сущность пробы заключается в том, что высокополимерная ДНК под воздействием соляной кислоты выпадает в нежный серо-белый осадок (преципитат). Если микроб выделяет фермент ДНК-азу, то в зоне его действия ДНК деполимеризуется и под влиянием соляной кислоты преципитат не образуется, агар в этой зоне остается прозрачным. Патогенные штаммы стафилококка об­ладают ДНК-азной активностью, вокруг колоний образуется зона просветления — деполимеризация ДНК.

Антигенная структура и фаготипы. У пато­генных стафилококков различают общий видовой протеиновый антиген и три полисахаридных антигена (А, В, С). Среди после­дних известно 15 типоспецифических антигенов (а, Ь, с, d и др.).

В эпизоотологическом отношении важно проведение фаготи-пирования стафилококков. Установлено, что одни фаготипы по­ражают человека, другие преимущественно обнаруживают у жи­вотных. Однако есть фаготипы (например, 42-Д), общие для жи­вотных и человека. Для типирования стафилококков используют специальный международный набор из 22 типов фагов. Этот на­бор можно применять для типирования стафилококков, выделен­ных только из пищевых продуктов (молоко, творог). Для типиро­вания стафилококков, выделенных из других источников живот­ного происхождения, используют другие типы фагов.

Стрептококки (Streptococcus). Принадлежат к порядку Eubacteriales, семейству Lactobacillaceae. По классификации Берд-жи стрептококки подразделяют на три группы: 1) гноеродные гемолитические — S. pyogenes (возбудители различных гнойно-вос­палительных процессов — абсцессов, флегмон, сепсиса), S. agaiac-tiae — возбудитель мастита коров, S. equi ~ возбудитель мыта ло­шадей; 2) зеленящие стрептококки —- S. viridans (термофильные, фекальные и др.); 3) молочнокислые стрептококки — S. lactis, S. cremoris. В основу современной классификации положен прин­цип антигенной структуры микроба. По группоспецифическим полисахаридным антигенам Лансфилд разделила стрептококки на 17 групп, из которых более детально изучены группы А, В, С и D, имеющие наибольшее практическое значение.

Возбудитель мастита коров. У коров мастит вызывают микро­бы более 80 видов, но основными, наиболее частыми возбудителя­ми являются маститный стрептококк — S. agalacliae (S. mastitidis) и патогенные стафилококки. Часто маститы бывают смешанной этиологии (стрепто-стафилококковые или в сочетании с синег-нойной палочкой, кишечной палочкой и другими микробами).

Микробиологическими исследованиями при мастите выявляют этиологию болезни и свойства возбудителя. Диагноз субклиничес­кого мастита ставят на основании результатов комплексного ис­следования: 1) клинического осмотра всех животных; 2) физико-химических анализов паренхимного молока (бромтимоловая про­ба, проба Уайтсайда, пробы с димастином или мастидином); 3) иммунологических показателей паренхимного молока —повы­шенное фагоцитарное число, положительная кольцевая реакция агглютинации с молоком и стрептококковым антигеном, окра­шенным гематоксилином, повышенное число лейкоцитов (проба отстаивания, разные методы подсчета); 4) бактериологического исследования.

Материал для бактериологического ис­следования. При клинически выраженном мастите в лабо­раторию направляют патологически измененный секрет вымени из каждого соска в отдельной стерильной пробирке. При подозре­нии на субклинический мастит первые порции молока сдаивают (их не используют), соски обрабатывают 70%-м спиртом, а затем в стерильные пробирки отдельно из каждого соска выдаивают не­сколько струек паренхимного молока и закрывают пробкой. Бак­териологическое исследование проводят не позднее 2 ч после взя­тия пробы.

Микроскопия. S. agalacliae — мелкие, чуть сплющенные или овальные кокки, располагающиеся в мазках из проб молока и воспалительного экссудата или жидкой питательной среды длин­ными цепочками (по нескольку десятков клеток). В мазках из культур, выросших на плотных питательных средах, микроб фор­мирует короткие цепочки. Спор и капсул не образует. Хорошо ок­рашивается всеми анилиновыми красками, грамположительный.

Для микроскопирования из исследуемого материала готовят тонкие препараты-мазки (подобно мазкам для гематологического исследования), высушивают их, фиксируют (лучше метиловым ал­коголем) и окрашивают азурэозином (краска Гимза) по методу Романовского или метиленовой синью Леффлера. Эти методы ок­раски дают возможность не только обнаружить стрептококки, но и выявить клеточные элементы в препарате, определить фагоци­тарное число. Обнаружение в мазках стрептококков и повышен­ного количества лейкоцитов указывает на воспаление молочной железы.

Культурально-биохимические свойства. Мас-титный стрептококк — аэроб, на обычных питательных средах ра­стет слабо. Хорошо культивируется на средах с добавлением де-фибринированной крови или кровяной сыворотки. В сывороточ­ном МПБ растет в виде мелкозернистого осадка, при этом среда остается прозрачной. На кровяном МПА образует мелкие (точеч­ные) блестящие сероватые колонии, окруженные зоной гемолиза (гемолиз (3-типа).

Чистую культуру стрептококка получают путем пластинчатого посева секрета на кровяной МПА в чашках Петри, суточного инку­бирования при 37 "С и последующей отвивки (пересева) типичной для данного микроба колонии на сывороточный МПБ и кровяной агар. Полученную культуру идентифицируют с учетом морфологи­ческих, культуральных, биохимических, гемолитических свойств и по антигенной структуре, которую выясняют в реакции диффузи­онной преципитации в агаровом геле или методом флуоресцирую­щих антител со специфическими сыворотками. Агалактийный стрептококк не разжижает МПЖ и свернутую сыворотку, не обесц­вечивает метиленовое молоко; лакмусовое молоко изменяет час­тично. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, лактозу, са­харозу, мальтозу, салицин. Не ферментирует сорбит и дульцит.

Штаммы, обладающие скрытой гемолитической способностью, видимой зоны гемолиза не образуют. Для выявления их потенци­альной гемолитической активности используют CAMP (КАМП)-метод, получивший свое название по первоначальным буквам фа­милий австралийских исследователей — Кристи, Аткинс и Мунх — Петерсон. Метод заключается в том, что на пластинчатый кровяной агар в чашке Петри по диаметру петлей высевают в виде прямой полоски р-гемолитический стафилококк. Отступив от нее 2...3 мм и перпендикулярно к ней, высевают исследуемые штаммы стрептококков (по 3...4). Сутки их выдерживают при 37 °С. Ага­лактийный стрептококк проявляет гемолиз в зоне, близкой к по­лоске выросшего стафилококка. По антигенной структуре S. agalactiae относят к серогруппе В.