Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 37 )

Реакция термоагглютинации. В пробирке 2...3-миллиардную взвесь бруцелл (смыв с агаровой культуры) прогревают в водяной бане при 90 °С в течение 45 мин и оставляют при комнатной тем­пературе. Результат учитывают через 30 мин, затем через 1 ч и окончательно через 24 ч. В диссоциированной культуре четко за­метна агглютинация. Если колонии типичны (S-формы), их пере­севают в пробирки на скошенный МПА. Выросшую культуру идентифицируют по следующим показателям: 1) отношение к ди­оксиду углерода — В. abortus для своего роста нуждается в повы­шенном содержании СО2 (до 10 %.), Br. melitensis и В. suis хорошо растут в обычных условиях; 2) образование сероводорода — наибо­лее интенсивно и более продолжительное время проявляется у В. suis, в меньшей степени — у В. abortus. В. melitensis, как правило, не продуцирует сероводород.

Бактериостатический метод. Дифференциация видов бруцелл основана на отношении к растворам красок, добав­ленных к питательным средам.

В пробирки с красками (каждой в отдельности) — фуксин (1:25 000), тионин (1:50 000...! : 100 000), добавленными к МППА,— высевают чистую культуру бруцелл. На среде с фукси­ном не растет В. suis, на среде с тионином не растет В. abortus. В. melitensis хорошо растет в присутствии этих красок.

Серологическая диагностика. В лабораторию направляют сыворотку крови. Последнюю исследуют с бруцеллез­ным антигеном методами РА и РСК. В производственных услови­ях в настоящее время используют методику исследования сыворо­ток по методу Кумбса. Все шире используют метод флуоресциру­ющих антител.

Аллергическая диагностика. В хозяйствах осно­вана на применении аллергенов — бруцеллизата, бруцеллогидро-лизата, бруцеллина. Последние в дозе 0,2 мл вводят внутрикожно и через 24...48 ч учитывают местную реакцию.

Биопрепараты, Живая сухая вакцина против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма № 82: отличается слабым серо­логическим ответом с быстрым снижением уровня гуморальных антител, что позволяет при помощи серологических реакций диф­ференцировать вакцинированных животных.

Высокоэффективна новая вакцина 75/79 АВ.

Единый бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК из культу­ры вакцинного штамма № 19.

Антиген для кольцевой реакции с молоком: микробную массу культуры В. abortus (штамм № 19) готовят, как для единого бру­целлезного антигена, инактивируют, устанавливают необходимую концентрацию микробных клеток, протравливают сульфатом же­леза, окрашивают в синий цвет гематоксилином, контролируют на стерильность, специфичность и активность.

Роз-бенгал антиген представляет собой суспензию бруцелл в буферном растворе (рН 3,6), инактивированных нагреванием и фенолом, окрашенных бенгальским розовым в малиново-розовый цвет.

Флуоресцирующая бруцеллезная сыворотка: готовят из пози­тивной бруцеллезной сыворотки, глобулины которой метят флуо-ресцеинизотиоцианатом.

Позитивная бруцеллезная сыворотка: получают гипериммуни­зацией животных-продуцентов. Используют для контроля при по­становке серологических реакций (РА, РСК и др.), а также серо­логической идентификации бруцелл.

Диагностический аллерген бруцеллин представляет собой сте­рильную, прозрачную, желтоватого цвета жидкость, содержащую продукты жизнедеятельности бруцелл и вещества, извлеченные из них

Возбудитель туляремии (Francisella tularensis). Открыт Мак-Коем и Чепиным (1912) в районе Туляре (Калифорния). Подробно изу­чен Френсисом (1921), в честь которого дано родовое название возбудителю. Относится к семейству Brucellaceae, роду Francisella. F. tularensis вызывает острое инфекционное заболевание животных и человека. Туляремия характеризуется септическим течением, поражением лимфатических узлов (набухание, творожистое пере­рождение), лихорадкой.

Бактериологическое исследование. В лабо­раторию при жизни животного посылают пунктат из увеличенных (мягких) лимфоузлов, абортированный плод (или органы плода), мочу, кал; после гибели животного — печень, почку, селезенку, увеличенные лимфоузлы от крупных животных. Трупы грызунов и других мелких животных направляют целиком.

Следует учитывать, что обнаружить возбудитель туляремии в препаратах-отпечатках возможно лишь при обильном обсемене­нии исследуемого материала.

Микроскопия. F. tularensis — мелкая коккоподооная бак­терия в мазках из культуры и тонкая палочка — в препаратах из органов. Величина 0,3 мкм. Споры не образует, неподвижная. В макроорганизме образует нежную капсулу. Грамотрицательна. По Романовскому — Гимза окрашивается в розово-голубой цвет, час­то биполярно.

Культуральные свойства. Аэроб. Оптимальная температура роста 37 °С, рН среды 6,7...7,4. На средах с кровью через 1...2сут появляются мелкие колонии беловатого цвета с го­лубоватым оттенком, круглые, выпуклые, с ровными краями, гладкие, блестящие. На жидких средах растет плохо. При культи­вировании следует учитывать, что для колоний типична гладкая S-форма, обладающая Vi - и О-антигенами, вирулентная и иммуно-генная. R-форма F. tularensis содержит лишь О-антиген. Авирулен-тна. При серологической диагностике учитывают наличие в бакте­рийной клетке антигенов, общих с бруцеллами. Для культивирования F. tularensis применяют специальные питатель­ные среды, такие, как желточная среда Мак-Коя, шоколадный агар Фрэнсиса, кровяная среда Емельяновой и др.

Среда Мак-Коя: на 60 частей куриных желтков добавляют 40 ча­стей стерильного физиологического раствора (дистиллированную воду для физраствора подщелачивают до рН 7,0...7,2). Для сверты­вания среду выдерживают при 80 °С 1 ч. Посев на среду произво­дят методом отпечатков: кусочек органа обжигают, разрезают сте­рильными ножницами и поверхность разреза прикладывают к по­верхности среды. Рост наблюдают уже через 18...24ч, максималь­ный рост —через 2...3сут. При слабом посеве отмечают редко расположенные колонии на З...6-е сутки.

Среда Фрэнсиса: к МПА с 1 % пептона и 0,5 % NaCl <pH 7,3) добавляют 0,1 % цистина и 1 % глюкозы. Кипятят несколько ми­нут, затем охлаждают до 50 °С и добавляют 10 % дефибринирован-ной стерильно полученной крови кролика.

Среда Емельяновой: в рыбно-дрожжевой агар вносят ОД % цис­тина и 1 % глюкозы. Затем агар расплавляют, охлаждают до 45 "С, добавляют 10 % дефибрированной крови и разливают по чашкам Петри или в пробирки. Данная среда более чувствительна, при­годна для получения изолированных колоний возбудителя туляре­мии.

Биохимические свойства. Выражены слабо, но на специальных питательных средах с пониженным содержанием белка F. tularensis ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннозу, глицерин, декстрин. Обладает проте-олитическими свойствами — расщепляет белки с образованием сероводорода. Индол не образует.

Биопроба. Белых мышей и морских свинок заражают сус­пензией растертых тканей патологического материала подкожно, в брюшную полость (в дозе 0,5 мл) или втиранием в кожу. Белые мыши погибают на 3...4-е сутки (иногда на 8 ...12-е сутки), морс­кие свинки — через 4...5 сут. Если материал инфицирован незна­чительно, гибель возможна на 8...15-е сутки. При вскрытии у павших лабораторных животных отмечают некротические очаги в легких, селезенке, печени, лимфатических узлах; их исследуют бактериологически.

Выделенную культуру идентифицируют пробирочным методом РА. В качестве антигена используют двухсуточную культуру, выра­щенную на среде Мак-Коя. Микробную массу снимают петлей (смывать нельзя), суспендируют в физиологическом растворе, дово­дят концентрацию до 5 млрд микробных клеток в 1 мл по стандарту для туляремийного микроба. Микробную взвесь в дозе 0,5 мл вносят в пробирки со специфической сывороткой в разных разведениях (не менее чем до 1:2000), встряхивают, помещают на 2 ч в термостат, за­тем оставляют при комнатной температуре на 20...22 ч. Положитель­ным результатом считают четко выраженную агглютинацию при полной прозрачности жидкости над агглютинатом.

Серологическая диагностика. Применяют РСК, как очень чувствительную, и РП для быстрой диагностики заболевания грызунов и пушных зверей. Антигеном служит экст­ракт из измельченных тканей поступившего в лабораторию трупа.

Тема 16. ПАСТЕРЕЛЛЫ

Возбудитель пастереллеза [Pasteurella multodda (P. septica)]. От­носят к семейству BruceHaceae, роду Pasteurelia. Название рода дано в честь Пастера, который впервые выделил одного из пред­ставителей данной группы (1879) — возбудителя холеры кур. P. multodda вызывает остропротекающее септическое заболевание сельскохозяйственных и диких животных (включая птиц). Пасте-реллез животных характеризуется наличием множественных ге­моррагии (кровоизлияний) во внутренних органах, на слизистых и серозных оболочках.

Для бактериологического исследования от крупных животных направляют кусочки паренхиматозных орга­нов, трубчатую кость (костный мозг). Трупы мелких животных посылают целиком.

Микроскопия. Препараты-отпечатки из тканей и орга­нов высушивают, фиксируют и окрашивают часть препаратов по Граму, часть по Романовскому — Гимза (или по методу Муромце­ва фуксин-синью или синью Леффлера с последующей обработ­кой в течение нескольких секунд 1 %-м раствором уксусной кис­лоты) или разведенным фуксином. Пастереллы — бактерии ово-идной формы, величиной от 0,25...0,5 до 2мкм, неподвижные, споры не образуют. Многие вирулентные свежевыделенные штам­мы формируют капсулу. Грамотрицательны. При окраске по мето­ду Муромцева или Романовского — Гимза (или синью Леффлера) в мазках из крови или органов окрашиваются биполярно, то есть более интенсивная окраска по полюсам клетки, центральная часть окрашена очень слабо.

Выделение чистой культуры. Возбудитель из патологического материала выделяют путем посева на питатель­ные среды МПБ и МПА (рН 7,2...7,4) лучше с добавлением кровя­ной сыворотки. Оптимальная температура роста 37 °С. Аэроб. На жидких средах в первые дни роста отмечают незначительное по­мутнение среды, затем образуется слизистый осадок, среда про­светляется. При встряхивании осадок не разбивается, а поднима­ется в виде «косички». На МПА пастереллы образуют гладкие, слегка выпуклые серовато-белые колонии S-формы, края ровные, слегка опалесцирующие. Колонии R-формы матовые, с голубова­тым отливом, шероховатые с неровными краями.