Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 16 )

Каталазная активность. Свойственна большинству аэробных микроорганизмов. Облигатные анаэробы и многие микроаэрофилы каталазу не образуют. Каталазную активность выявляют следующим образом. Исследуемый микроорганизм выращивают на поверхности плотной питательной среды. Нано­сят каплю 10%-го раствора Н2О3 на колонию или суспендируют клетки исследуемого микроорганизма в небольшом объеме этого раствора. Выделение О2, хорошо заметное по образованию пу­зырьков, свидетельствует о наличии в клетках каталазы. Можно выращивать бактерии и в жидкой среде. В этом случае к 1 мл жидкой культуры добавляют I мл раствора НгО^: значение рН должно быть около 7.

Отношение к температуре. Подавляющее боль­шинство микроорганизмов, с которыми имеют дело в лаборатор­ных условиях, принадлежат к мезофилам. Однако оптимальная температура для роста микроорганизмов этой группы имеет доста­точно широкий диапазон— от 20 до 45 °С. Поэтому необходимо определить температуру, обеспечивающую оптимальный рост изу­чаемого организма.

Для этого штрихом засевают скощенные плотные питательные среды в 10 пробирках. Пробирки затем по две помещают в термо­статы с температурой 20, 30, 37, 42 и 48 °С. Через 2...3 сут отмеча­ют интенсивность роста исследуемого макроорганизма визуально по 4-балльной шкале: 0 —отсутствие роста, «+» —слабый рост, «++» —хороший рост; «+++» — очень хороший рост.

После первого пассажа проводят второй пассаж с той лишь раз­ницей, что для каждой температуры посевным материалом служат клетки соответствующего первого пассажа. Пробирки вновь поме­щают в термостаты с различной температурой; через 2...3 сут отме­чают рост и его интенсивность.

Чаще используют следующие методы регистрации фермента­тивной активности микроорганизмов.

Выявление сахаролитической активнос­ти микроорганизмов. В состав дифференциально-ди­агностических углеводных сред (среды Гисса) входят различные со­единения, которые можно условно назвать сахарами: моносахари­ды, полисахариды, многоатомные спирты. При утилизации углево­дов в качестве конечных продуктов образуются кислоты и газообразные продукты. Соответственно расщепление углевода регистрируют по изменению рН среды и выделению газообразных продуктов. Закисление питательной среды улавливают при помощи различных индикаторов. Индикатор ВР, входящий в состав сухих сред Гисса, меняет цвет от розового в щелочной среде через серый при нейтральном рН до голубого или ярко-синего в кислой среде.

Индикатор Андрэдэ (кислый фуксин— 0,5 г, 1%-й раствор гид-роксида натрия — 16 мл, дистиллированная вода — 84 мл) при за-кислении дает покраснение среды. В жидких средах Гисса образо­вание газов при утилизации субстрата улавливают при помощи поплавков («газовок») — стеклянных трубочек, запаянных в верх­нем конце и помещенных в пробирки. В «газовках» скапливаются газы, вытесняющие жидкую питательную среду; в полужидких средах Гисса газообразные продукты остаются в толше среды в виде пузырьков.

Ферментация углеводов иногда происходит медленно, поэтому предварительный учет результатов проводят через 24...48 ч, а окончательный — через 1О...14сут инкубирования посевов.

Тест с метиловым красным показывает степень закисления сре­ды при расщеплении глюкозы. Метилрот как индикатор срабаты­вает в диапазоне рН 4,4...6,0. Исследуемую культуру выращивают 2...5сут в жидкой среде Кларка с глюкозой. Затем на 5 мл среды добавляют 5...6 капель раствора метилрота. Положительный ре­зультат — покраснение среды после внесения индикатора (рН 4,0...5,0).

Среда Кларка: пептон —5 г, гидрофосфат калия —5 г, глюко­за — 5 г, вода дистиллированная — 1000 мл. Ингредиенты раство­ряют в воде, кипятят 2...3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, доводят рН до 6,9...7,0, разливают по пробиркам и стери­лизуют при 112 °С 20 мин.

Тест Фогеса — Проскауера выявляет промежуточный продукт расщепления глюкозы — ацетоин (ацетилметилкарбинол, диметил-кетон). Исследуемую культуру выращивают на среде Кларка. К 1 мл культуры добавляют 0,6 мл 5%-го раствора анафтола, перемешива­ют, вносят 0,2 мл 40%-го раствора гидроксида калия и инкубируют 1 ч. Положительная реакция — красное окрашивание среды.

Выявление протеолитических и других ферментов микроорганизмов. Протеолитические ферменты расщепляют белки питательной среды до промежуточ­ных (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или конечных (се­роводород, индол, аммиак) продуктов.

Характер роста микроорганизма на молоке. При посеве исследу­емой культуры бактерий на стерильное обезжиренное молоко можно выявить фермент, расщепляющий молочный сахар (лакто­зу), и протеолитические ферменты, действующие на молочный белок (казеин). Расщепление лактозы приводит к закислению и свертыванию молока, при выделении протеолитических фермен­тов казеин постепенно растворяется — пептонизируется, в результате чего молоко просветляется, приобретает легкий кремовый от­тенок, а на дне пробирки формируется осадок. Свертывание мо­лока может также происходить под влиянием выделяемого неко­торыми бактериями «сычужного» фермента, в этом случае реак­ция молока бывает щелочной. Иногда возможна пептонизация ка­зеина без свертывания молока.

Тест на гидролиз казеина в плотных питательных средах. Обез­жиренное молоко диализуют для удаления лактозы, которая инги-бирует гидролиз казеина. В расплавленный питательный агар с двойной концентрацией агар-агара добавляют равный объем сте­рилизованного автоклавированием диал изо ванного молока. Ис­следуемую культуру бактерий засевают «штрихом» на поверхность питательной среды, разлитой в чашки Петри. Посевы инкубируют до 14сут. Перед учетом результатов поверхность среды заливают 10%-м раствором соляной кислоты. Положительный результат — просветление среды вокруг колоний.

Тест на уреазу. Исследуемую культуру микроорганизма засева­ют на среду Кристенсена (пептон — 1 г, хлорид натрия — 5 г, ди-гидрофосфат калия —2 г, агар —20г, глюкоза— 1 г, 0,2%-й ра­створ фенолрота —6мл, 20%-й раствор мочевины— 100мл, вода дистиллированная —1000 мл) и выращивают 1...4сут. Положи­тельный результат — покраснение среды в результате ее защелачи-вания.

Тест на редукцию нитратов. Выявляет восстановление нитра­тов до нитритов. Культуру микроорганизма засевают в МПБ, со­держащий 0,2% нитрата калия, инкубируют 48...12 ч. Затем в опытную и контрольную пробирки добавляют по 1 мл реактива с крахмалом (растворимый крахмал — I г, вода дистиллированная— 100 мл, йодид калия — 0,5 г). К этому раствору перед постановкой реакции добавляют несколько капель 10%-го раствора соляной кислоты. Положительный результат-—темно-синее окрашивание.

Тест на общую фосфатазу. Исследуемую культуру микроорга­низма засевают «штрихом» на поверхность питательного агара с натриевой солью дифосфата фенолфталеина, инкубируют 4...5 сут. Чашки переворачивают вниз крышкой, на внутреннюю поверх­ность которой наносят каплю 28...30%-го раствора нашатырного спирта. При наличии фосфатазы колонии приобретают красный цвет.

Тест на оксидазу. Фильтровальную бумагу пропитывают 1%-м раствором тетраметилпарафенилендиамина дигидрохлорида. Бак­териальную массу петлей наносят на поверхность бумажной по­лоски. Положительный результат — фиолетовое или пурпурное окрашивание через 10...60 с.

Определение гемолитических свойств. Некоторые виды бактерий в процессе своей жизнедеятельности вырабатывают особые веще­ства белковой природы —гемотоксины, обладающие лизирую-щим действием на эритроциты. Для определения гемолитической способности производят посевы на питательные среды, содержа­щие 5 % дефибринированной крови. Чаще используют кровяной МГЛА. При росте на кровяной среде микроорганизмов, обладаю­щих гемолитическими свойствами, вокруг колонии в результате лизиса эритроцитов образуется прозрачная зона (бесцветная или окрашенная). В жидких питательных средах при гемолизе среда делается прозрачной (красная лаковая кровь).

Тест на редуцирующую способность бак­терий (в метиленовом молоке) основан на следующей особен­ности: при окислительно-восстановительных реакциях у бактерий акцептором водорода может быть кроме молекулярного кислорода ряд органических красителей, которые, присоединяя водород, восстанавливаются и обесцвечиваются. Такие свойства отмечены у лакмусовой настойки, метиленовой сини, малахитового зелено­го и др. Например, молоко с метиленовой синью готовят так: мо­локо подщелачивают 10%-м раствором карбоната натрия до рН 7,2 и добавляют 20 мл 1%-го водного раствора метиленовой сини на 1000 мл. Готовая среда голубого цвета. Результат учитывают че­рез сутки инкубирования посевов. В случае редукции красителя среда окрашена в кремовый цвет.

Тест-системы для быстрой идентифика­ции бактерий по группе специально отобранных биохи­мических признаков обычно представляют собой пластмассовые пластины с лунками (микропробирками), заполненными различ­ными сухими средами (субстратами). В эти среды вносят суспен­зию исследуемой культуры и после инкубирования учитывают ре­зультат. К тест-системам прилагают таблицы для учета результатов и идентификации микроорганизмов в зависимости от спектра вы­явленных ферментов.

Разработаны тест-системы для идентификации энтеробакте-рий, анаэробов, несбраживающих бактерий и т. д. Нижегородский институт микробиологии и эпидемиологии выпускает тест-систе­му подобного типа — биохимические пластины для идентифика­ции энтеробактерий (ПБДЭ), кроме того, разработаны тест-систе­мы для санитарно-микробиологических целей.

Принципы идентификации микроорганизмов. Основная задача бактериологического диагностического исследования — это опре­деление таксономического положения выделенного микроорганиз­ма путем сравнения его свойств со свойствами известных видов.

В рутинной бактериологической практике микроорганизм идентифицируют, изучая его фенотипические признаки (мор­фологические, тинкториальные, культуральные, биохимичес­кие, патогенные). Стали получать распространение некоторые методы идентификации по генотипическим признакам, кото­рые ранее в основном применяли в научной работе для класси­фикации микроорганизмов с неясным таксономическим поло­жением.

В бактериологии для идентификации используют определите­ли микроорганизмов. Наиболее популярный — определитель бак­терий Берджи — включает в себя описание свойств известных ви­дов микроорганизмов. Бактерии в этом руководстве по ограни­ченному числу морфологических и физиологических признаков объединены в большие группы. В пределах этих групп при помо­щи нескольких дифференцирующих признаков бактерии подраз­делены на семейства, роды и виды. Распределение микроорганиз­мов в этом определителе не отражает иерархической классифика­ции, а преследует сугубо практическую цель — как можно быстрее и экономичнее установить таксономическое положение изучаемо­го микроорганизма.