Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии (стр. 29 )

Для титрования комплемента в гемолитической системе готовят компоненты: комплемент в разведении 1 : 20 (1 мл комплемента + 19 мл физраствора); гемолизин, разведенный соответственно ра­бочему титру; взвесь отмытых эритроцитов барана (1: 40), физио­логический раствор. В штатив ставят пробирки и разливают в них градуированной пипеткой разное количество комплемента с ин­тервалом 0,03 мл (0,13; 0,16; 0,19; 0,22..: до 0,43 мл). Затем добав­ляют остальные компоненты (рис. 57). Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37...38 "С на 10...15 мин и прово­дят учет результата.

Учет результата: наименьшее количество комплемента, обеспе­чившее полный гемолиз (в данном примере — 0,25 мл), принима­ют за титр комплемента.

Результат титрования начинают учитывать в пробирках с наи­большим содержанием комплемента, где прежде всего ожидается гемолиз. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный гемолиз эритроцитов при данных условиях, называют титром комплемента в гемолитической системе.

Для титрования комплемента в бактериолитической системе необходимо иметь все компоненты реакции: комплемент (1:20), эритроциты (1: 40), гемолизин в рабочем титре, две позитивные и две нормальные сыворотки, специфический антиген. Сыворотки разводят физраствором 1 : 10, инактивируют 30 мин при 56...58 X. Каждую сыворотку разливают в два ряда пробирок по 0,5 мл. В пробирки каждого ряда добавляют комплемент в возрастающих количествах, как при титровании в гемолитической системе; на­чинают с количества, принятого за титр в гемолитической систе­ме, затем в каждой последующей пробирке дозу увеличивают на 0,03 мл, выравнивая объем до 0,5 мл физиологическим раствором.

После этого в один ряд пробирок с позитивной и нормальной сы­воротками добавляют по 0,5 мл антигена, во второй ряд каждой сы­воротки—по 0,5 мл физиологического раствора. Все пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 30...40мин. Затем во все пробирки вносят по 0,5 мл гемолизина и по 0,5 мл эритроцитов, встряхивают и вторично помещают в водяную баню на 10...15 мин. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный лизис эритроцитов в обоих рядах пробирок (с антигеном и без антигена) двух нормальных сывороток, в одном ряду (без антигена) каждой по­зитивной сыворотки и с полной задержкой (отсутствием) гемолиза в рядах позитивных сывороток с антигеном (в тех же дозах комплемен­та), называют титром комплемента, который используют в поста­новке главного опыта РСК при диагностических исследованиях.

Главный опыт РСК (собственно диагностическое исследование). В штативы ставят два ряда пробирок по количеству исследуемых проб сывороток. По 0,5 мл каждой инактивирован-ной сыворотки наливают в две пробирки: в одну добавляют анти­ген — 0,5 мл, в другую (без антигена) 0,5 мл физраствора и, доба­вив комплемент, составляют бактернолитическую систему, а затем добавляют гемолитическую.

. Необходимые компоненты: 1) исследуемая сыворотка, инактивированная, разве­денная физиологическим раствором 1: 10; 2) специфический ан­тиген, разведенный согласно титру, указанному биофабрикой на этикетке упаковки; 3) комплемент в установленном титре; 4) ге­молизин в рабочем титре; 5) взвесь отмытых эритроцитов барана 1: 40; 6) физиологический раствор NaCI. Исследуемые сыворотки разливают в два ряда пробирок. Для любого количества исследуе­мых сывороток в качестве контроля используют заведомо пози­тивную сыворотку (дающую положительный результат) и нор­мальную (от здорового животного, дающую отрицательный ре­зультат).

Пробирки с компонентами бактериолитической системы встряхивают, помещают в водяную баню на 20...40 мин при 37...38°С. Пробирки бактериолитической системы второго ряда без антигена встряхивают, помещают в водяную баню при тех же условиях.

Затем во все пробирки первого и второго ряда добавляют ком­поненты гемолитической системы, вторично помещают в водяную баню на 10..15 мин. Во всех пробирках второго ряда без антигена наступает полный гемолиз.

До получения оконча­тельного результата пробир­ки оставляют при комнат­ной температуре на 18...24 ч. Во всех пробирках без анти­гена, независимо, от боль­ного или от здорового жи­вотного получена сыворотка, должен наступить гемолиз, в пробирках первого ряда с антиге­ном более четкий результат выражен при отстаивании.

Показания реакции в пробирках с испытуемыми сыворотками считают достоверными, если в пробирках с позитивными сыво­ротками и антигеном гемолиз отсутствует при полном гемолизе в пробирках с позитивной сывороткой без антигена и во всех про­бирках с заведомо нормальной сывороткой (рис. 61).

Данная реакция должна сопровождаться контролями антигена, комплемента, гемолизина, эритроцитов. Для этого в отдельные пробирки наливают антиген с эритроцитами барана; комплемент с эритроцитами без гемолизина; гемолизин с эритроцитами без комплемента; эритроциты и физиологический раствор. Объем в каждой пробирке доводят физраствором до 2,5 мл. Пробирки встряхивают, помещают в водяную баню при 37 °С на 20 мин. Во всех контрольных пробирках гемолиз должен отсутствовать.

Результат РСК принято выражать в «крестах». Показатели по­ложительного результата реакции: + + + + (///) — полное осаж­дение эритроцитов (нет гемолиза), жидкость над осадком бесцвет­ная, + + + (///) — жидкость над осадком едва заметно окрашена в желтоватый цвет. Сомнительный результат реакции: наличие осевших на дне эритроцитов и частичное окрашивание надосадоч-ной жидкости за счет лизиса некоторой части эритроцитов обо­значают + + — (++ ), то есть два и два с половиной креста. Резко выраженный гемолиз (без осадка) или с небольшим осадком (+) — отрицательный результат.

Реакция длительного связывания комплемента (РДСК). Более эффективная по чувствительности в отличие от обычной класси­ческой РСК. Суть реакции заключается в том, что бактериолити-ческую систему выдерживают при трех различных температурных режимах: после смешения компонентов при комнатной темпера­туре 15 мин, затем при низкой температуре (4 °С) в рефрижераторе 18...20 ч и в водяной бане 15 мин. После этого добавляют гемоли­тическую систему, встряхивают, вновь помешают в водяную баню и производят учет реакции, как при РСК. Подтверждена эффек­тивность РДСК при диагностике ряда инфекционных болезней (туберкулез, вибриоз, бруцеллез идр,).

Реакция подавления связывания комплемента (РПСК), или реак­ция торможения, непрямая РСК. В данной реакции участвует еще один компонент — стандартная иммунная сыворотка, содержащая антитела к антигену, используемому обычно для диагностики и, следовательно, положительно реагирующая в классической РСК.

Исследуемую сыворотку смешивают с антигеном и некоторое время выдерживают без комплемента. Затем добавляют компле­мент и стандартную сыворотку, пробирки встряхивают и помеща­ют в водяную баню на 20...30 мин, после чего добавляют гемоли­тическую систему и вновь ставят в водяную баню. Если нет гемо­лиза—результат отрицательный, потому что испытуемая сыво­ротка не реагировала с антигеном и последний вступил в реакцию со стандартной сывороткой, связав комплемент. Если исследуемая сыворотка от больного животного, она содержит специфические антитела по отношению к антигену, т. е. происходит реакция меж­ду антигеном и антителами, не связывая комплемент. Антиген, взаимодействуя с антителами исследуемой сыворотки, не вступает в реакцию (подавляется) со стандартной (заведомо известной спе­цифической) сывороткой, комплемент остается свободным и вступает в реакцию в гемолитической системе — происходит гемо­лиз, результат реакции положительный по отношению к исследуе­мой сыворотке.

Метод флуоресцирующих антител (МФА). Возможности данно­го метода обусловлены специфичностью первой фазы серологи­ческих реакций с высокой чувствительностью люминесцентного анализа. Для осуществления МФА необходимо иметь высокоспе­цифические иммунные люминесцирующие сыворотки. Известно, что в различных серологических реакциях, используемых в мик­робиологической практике, участвуют преимущественно три ком­понента: бактерийный антиген, антитело и комплемент. Все три компонента, по сути, являются антигенами, и против каждого из них могут быть получены иммунные сыворотки и, соответствен­но, люминесцирующие антитела. В зависимости от того, какого типа люминесцируюшую сыворотку используют (против бакте­рийного антигена, антибактериальных антител, комплемента), различают три основных варианта метода флуоресцирующих ан­тител: прямой (1) и непрямой (2) варианты и модификация непря­мого варианта с использованием комплемента. Иммунологичес­кая реакция между антигеном и антителом осуществляется в этих модификациях непосредственно на предметном стекле. Для фик­сации микроорганизмов применяют органические растворители: ацетон, этанол, метанол, диоксан, а также обычные фиксаторы, используемые в микробиологической практике: формалин, смесь Никифорова, жидкость Карнуа и др.

Прямой вариант. На готовый препарат наносят специ­фическую люминесцирующую сыворотку на определенное время, затем излишек сыворотки сливают, препарат промывают и про­сматривают в люминесцентном микроскопе. Этот метод применя­ют для обнаружения бактерий в патологическом материале, объектах внешней среды, а также для идентификации возбудите­лей заболеваний в культурах.

Непрямой (двухступенчатый) вариант. На первом этапе происходит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом немеченой сыворотки. На втором этапе специфическое немеченое антитело связывается с антивидо-вым люминесцирующим антителом, содержащимся в сыворотке животного, иммунизированного глобулинами (или цельной сыво­роткой крови) того вида животных, от которых была использована иммунная сыворотка.

Непрямой антикомплементарный (трех­ступенчатый) вариант. Первый этап: образование ком­плекса антиген — немеченое антитело. Второй этап: наслаивание нормальной сыворотки, содержащей комплемент. Третий этап: комплекс антиген — антитело — комплемент обрабатывают люми-несцируюшей антикомплементарной сывороткой, приготовлен­ной при иммунизации кроликов сывороткой того вида животного, которое служило источником комплемента.

Непрямые варианты МФА можно использовать как для выяв­ления антигенов, так и для определения антител. Кроме того, для постановки двухступенчатого варианта нужно иметь ограничен­ный набор антивидовых люминесцирующих сывороток (против глобулинов быка, барана, лошади, свиньи и др.), а для антикомп­лементарного варианта достаточно иметь всего одну люминесци­рующую сыворотку против глобулинов морской свинки.