Гематологія і переливання крові (стр. 13 )

ИФА-диагностика HВV находится в другой ситуации, на практике нашли применение многочисленные тест-системы на серологические маркеры HВV.

Цель. В связи с выше изложенным, целью нашего исследования было определение роли молекулярно-биологических и серологических маркеров HСV и HВV в диагностике гепатитов С и В на примере образцов собранной плазмы и сыворотки крови пациентов инфекционного отделения.

Материалы и методы исследования. Материалом для исследования служили образцы плазмы и/или сыворотки крови, отобранные у пациентов инфекционного отделения клинической больницы № 15 г. Киева.

Для определения маркеров HСV и HВV методом ИФА использо­вали такие тест-системы: «DIA-HCV III» – Ат ВГС; «DIA-HВV»,
«ДС-ИФА-HBsAg-0,01» – HBsAg HBV; «DIA-HB core» – Ат HBV; «ДС-ИФА-анти HBs» – Ат HBV.

Для определения последовательностей РНК HCV и ДНК HBV молекулярно-биологическим методом использовали тест-системы «АмплиСенс HCV-240/ВКО-440», «АмплиСенсHВV-470/ВКО-770»
с заявленной аналитической чувствительностью соответственно
1000 МЕ/мл и 1000 коп/мл и электрофоретической детекцией.

Было проанализировано 42 образца сыворотки на серологические и молекулярно-биологические маркеры HCV (анти-HCV, РНК HCV) и 47 образцов на маркеры HBV (HBsAg, анти-HBcore, ДНК HBV).

Каждый образец сыворотки крови тестировался индивидуально.

Результаты и их обсуждение. Во всех исследуемых образцах сыворотки крови был выявлен серологический маркер HCV – анти-HCV, образцы имели значения оптической плотности (ОП) при анализе в ИФА от 0,179 до 3,841 оптических единиц (о. е.). Молекулярно-биологический маркер – последовательности РНК HCV был обнаружен у 52,4% обследованных, у 47,6% – РНК HCV не была выявлена (табл. 1).

Таблица 1

Результаты тестирования сыворотки крови пациентов на антитела HCV и РНК HCV

Маркеры	Результаты ИФА в образцах ОТ-ПЦР (-)	Результаты ИФА в образцах ОТ-ПЦР (+)
	Количество	%	Количество	%
Всего	20	47,6	22	52,4
Анти-HCV высокие значения ОП (от 2 о. е. и выше)	17	40,5	16	38,1
Анти-HCV низкие значения ОП (ниже 2 о. е.)	3	7,1	6	14,3

Несмотря на то, что нарастание концентрации ДНК HBV происходит медленнее, чем РНК HCV, HBV значительно стабильнее и обладает высокой контагиозностью. Для HBV доза заражения составляет от 10 до 100 вирусных частиц, т. е. достаточно инокуляции всего 0,0005 мл крови, которая содержит вирус. Результаты тестирования на HBV представлены в таблице 2 в различных сочетаниях трех маркеров.

Таблица 2

Распределение серологических и молекулярно-биологических маркеров HBV в сыворотке крови больных

Номер группы	Серологические и молекулярно-биологические маркеры	Количество
абсолютное	%
1	HBsAg (+) ДНК (+) Анти-HBcore (+)	15	34
2	HBsAg (-) ДНК (+) Анти-HBcore (+)	2	4,3
3	HBsAg (+) ДНК (+) Анти-HBcore (-)	10	21,3
4	HBsAg (+) ДНК (-) Анти-HBcore (-)	4	8,5
5	HBsAg (-) ДНК (-) Анти-HBcore (+)	8	19
6	HBsAg (+) ДНК (-) Анти-HBcore (+)	4	9,5

Из таблицы 2 видно, что в зависимости от полученных результатов, сыворотки условно можно разделить на 6 групп. Три группы, в которых была выделена ДНК HBV, и не были обнаружены или присутствовали серологические маркеры HBsAg и анти-HBcore. Три группы, в которых отсутствовал молекулярно-генетический маркер HBV, но присутствовали серологические маркеры в различных сочетаниях. Наиболее численная группа 15 случаев (34%) из 44 образцов включала в себя все тестируемые нами маркеры. В наименее численной группе 2 случая (4,3%) из 47 образцов отсутствовал только маркер HBsAg. Во всех 6 группах серологические маркеры распределены так, что независимо от результатов тестирования ПЦР в образцах подтверждался гепатит В присутствием либо HBsAg или анти-HBcore, либо присутствием обоих серологических маркеров. В группах 5 и 6 образцы дополнительно тестировали на анти-HBsAg, в сыворотках присутствовали Ат к HBsAg.

Результаты тестирований образцов сыворотки крови инфицированных больных на маркеры HCV свидетельствуют о том, что во всех исследованных образцах присутствовал серологический маркер Ат-HCV, однако молекулярно-биологический маркер был выявлен лишь в 52,4% случаев. Что можно объяснить либо недостаточ­ной чувствительностью используемой тест-системы (1000 МЕ/мл), в том числе субтиповым несовпадением вируса в тестируемом образце с используемой тест-системой, либо отсутствием этого маркера в 47,6% тестируемых образцах. Корреляция между РНК HCV и анти-HCV составляла ≈50%. По данным Schreiber G. B. et al. [13], внедрение дополнительного тестирования ПЦР позволило сократить неопределенный период для HCV на 50 дней (72%), для HBV на
25 дней (52%). Для решения проблемы с образцами, содержащими низкий уровень HCV (ниже предела чувствительности используемой тест-системы), испанскими исследователями было предложено концентрирование вирусных частиц ультрацентрифугированием тестируемых образцов сыворотки 17 час при 100000 g до постановки ПЦР. Это позволило выявить ложноотрицательные образцы у пациентов, которым проводилась интерферонотерапия [14].

Время удвоения HCV составляет 17,7 часов по сравнению с
2,8 днями для HBV. Для HCV характерны не только случаи с длительным периодом серонегативности (иногда до 193 дней) в присутствии РНК, но описаны также случаи спонтанного исчезновения АТ к HCV или «серореинверсии» как у иммунокомпетентных, так и иммуно­дефицит­ных пациентов, инфицированных HCV [4].

Интересный подход к сокращению периода серологического окна предложила в своем изобретении доктор Jehuda-Cohen T. Для того, чтобы снять супрессивное действие системы цитокинов организма, исследуемую кровь (а вместе с ней и HCV-специфичные лимфоциты, праймированные in vivo) переносили в условия in vitro (в специально разработанную ростовую среду, в пробирку) и культивировали 5–7 дней. После этого надосадочную жидкость тестировали на наличие АТ HCV стандартным методом [15]. Тест-система позволяет избежать как «ложноотрицательных», так и «ложноположительных» результатов. Была исследована кровь 4673 пациентов, у 573 пациентов были выявлены АТ HCV методом ИФА. Использование вспомогательной технологии культивирования в пробирке позволило дополнительно выявить АТ HCV еще у 19 пациентов. У 110 пациентов при гемодиализе методом ИФА были выявлены АТ HCV. В 2 образцах, после культивирования в пробирке, АТ HCV не были обнаружены. Тест-система прошла контрольные, многоцентровые клинические исследования в ряде стран государственными органами регистрации, академическими учреждениями, медицинскими учреждениями, референс-лабораториями, банками крови. В России тест-система используется с июля 2008 года.

NAT-скрининг HCV в США к середине 2000 года применялся уже для 99% заготавливаемой крови. HCV может быть обнаружен в крови только по наличию РНК, т. к. уровень вирусных АГ в сыворотке крови ниже порога чувствительности современных иммунохимических тестов. В соответствии с опытом стран Европы для перехода к NAT-тестированию пулов из 96 донаций применяют центрифугирование пулов при 40 000 g в течение одного часа для концентрирования вирусов, а также определяют лимит детекции вирусов на основе международных стандартов с известной концентрацией этих вирусов [16].

В ноябре 1997 года для увеличения вирусной безопасности продуктов крови Красный Крест Японии ввел NAT-тестирование на HCV, HBV и HIV прошедшей серологический скрининг исходной плазмы, в июле 1999 года – внедрил NAT-скрининг в практику трансфузиологии [4].

Тем не менее NAT-тестирование на ДНК-HBV остается открытым [17]. В США введение NAT-скринирования цельной крови на HBV не внедрено, т. к. ожидается появление новых тестов для обнаружения HBsAg, которые будут иметь сравнимую с минипул-NAT или более высокую чувствительность обнаружения HBV [18]. В настоящее время оба метода продолжают совершенствоваться и предлагаемый минипул-NAT имеет лишь минимальное преимущество по сравнению с новыми HBsAg-ИФА-тестами. Опубликовано много данных о том, что имеются немногочисленные донации, которые негативны по HBsAg, позитивны по анти-HBcore и содержат ДНК HBV в очень низких концентрациях – 100 вирусных копий/мл или менее. В нашем исследовании встречались такие сыворотки (табл. 2), правда, это самая малочисленная группа – 2 образца (4,3%). В работах гепатологов такие случаи носят название «скрытой», «оккультной», «молчащей» или латентной HBsAg-негативной HBV-инфекции. Объясняется это наличием «ускользающего» (мутантного) варианта 0вируса и низким уровнем репликации HBV и экспрессии вирусных белков. А также особенностями исследуемой группы лиц и эндемичностью изучаемого региона [19, 20].

Проанализировав сочетание трех маркеров HBV в плазме и/или сыворотке крови человека, полученные в нашем исследовании, можно сделать заключение, что тестирование на серологические маркеры HBsAg и анти-НВсore позволило выявить образцы, инфицированные HBV. Применение чувствительной тест-системы на HBsAg в сочетании с анти-HBcore тестированием обеспечивает необходимый низкий уровень остаточного риска 1:205000 [21].

В последние годы все больше и больше набирают темпы исследования такого биомаркера, как микроРНК (microRNA), в том числе и при инфекционных заболеваниях (HCV, HIV). Известно, что 30% генов человека регулируется микроРНК [22]. В зарубежных лабораториях идет наработка экспериментальных данных, в том числе клинических. Стабильность микроРНК в сыворотке и плазме стала следствием быстрорастущего интереса к использованию микроРНК крови как диагностического и прогностического маркера.