Гематологія і переливання крові (стр. 21 )

Key words: chronic myeloid leukemia, CD4+CD25+-(Treg-) lymphocytes, autoantibody to native double string DNA (dsDNA).

Введение. Хроническая миелоидная лейкемия (ХМЛ) относится к группе миелопролиферативных заболеваний и возникает в результате злокачественной трансформации полипотентной гемопоэтической стволовой клетки костного мозга (КМ) с последующей клональной пролиферацией клеток одной или нескольких линий миелопоэза, которые сохраняют способность к дифференцировке. У 95% больных опухолевые клетки КМ и периферической крови (ПК) несут Филадельфийскую хромосому (Ph-хромосома), появляющуюся в результате транслокации генетического материала между хромо­сомами t(9, 22) [1], что является основным пусковым механизмом заболевания. Кроме того, генный продукт BCR/ABL служит молекулярной основой в развитии ХМЛ [2].

Наряду с молекулярно-генетическими изменениями гемопоэза, ХМЛ сопровождается существенными сдвигами в иммунной системе больных [3]. Так, при данном заболевании наблюдается функцио­нальная неполноценность клеток, контролирующих состояние противоопухолевого и противоинфекционного иммунитета. Доста­точно часто у больных ХМЛ наблюдаются аутоиммунные процессы. Одной из причин, способствующих их развитию, является реакция иммунной системы на собственные (self) аутоантигены. Это происходит из-за нарушения иммунологической толерантности организма, контролируемой различными механизмами. Как известно, в еe поддержании участвуют Т-регуляторные лимфоциты (Treg) с иммунофенотипическими признаками CD4+-, коэкспрессирующие мембранный антиген CD25 (низкоаффинный рецептор к ИЛ-2, альфа-цепь) [4]. В литературе не найдено сведений относительно механизмов, которые приводят к срыву иммунологической толерантности у больных ХМЛ, вследствие чего появляются аутоантитела к собствен­ным антигенам. Исследования в этом направлении открывают перспек­тивы для выяснения роли аутоиммунных процессов в патогенезе ХМЛ.

Цель исследования – охарактеризовать интенсивность аутоим­мунных реакций у больных ХМЛ и изучить корреляционную взаимосвязь между степенью выраженности аутоиммунных рас­стройств и количеством Тreg-лимфоцитов.

Материалы и методы. Иммунологические исследования были проведены 56 больным ХМЛ. Определение фаз заболевания в данной группе больных основывалось на общепринятых клинико-гематологических критериях. Материалом для исследований являлись клетки ПК больных ХМЛ в фазе акселерации (ФА, n=21) до начала лечения, после терапии гидроксимочевиной в хронической фазе (ХФ1, n=20) и иматинибом (ХФ2, n=15). Контрольную группу составили практически здоровые лица (n=50).

Для определения относительного содержания в ПК Тreg-лимфо­цитов образцы окрашивали в прямом двухцветном иммуно­флюоресцентном тесте анти - CD25+- и анти-CD4+ моноклональными антителами (МКА) фирмы Becton Dickinson (USA), мечеными соответственно флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (PE). Для контроля уровня неспецифического связывания конъюгатов МКА образцы окрашивали мышиными МКА против гемоцианина фиссуреллы (Keyhole limpet) субклассов IgG1 и IgG2а, мечеными соответственно FITC и PE. Цитофлюориметрические исследования осуществляли на проточном лазерном цитофлюориметре FACScan Becton Dickinson с использованием для сбора и обработки результатов программы LYSYS-II Ver.1.1. (Becton Dickinson, USA); WinMDI 2,8 (Joseph Trotter, Scripps Institute, La Jolla, CA) и Microsoft Exsel 2000 из пакета Microsoft Office 2000. Оценку экспрессии изучаемых маркеров осуществляли в регионе лимфоцитов, который выделяли с учетом параметров бокового (SSC) и переднего (FSC) светорассеяния (линей­ное усиление сигналов), а также показателям флюоресценции по двум каналам (FL1, FL2, логарифмическое усиление сигналов). Показатели флюоресценции учитывались при использовании анти-CD45+/CD14+ МКА, меченых двумя разными флюорохромами (FITC и PE).

Содержание в сыворотке крови аутоантител классов М и G к нативной двунитевой ДНК (анти-dsДНК-IgM, анти-dsДНК-IgG) у больных лейкемией и лиц контрольной группы (n=30) изучали на основании протоколов, разработанных в лаборатории клинической иммунологии ЦНИЛ Крымского государственного медицинского университета им. , Симферополь [5]. Оптическую плотность конечного продукта ферментативной реакции определяли с помощью иммуноферментного анализатора АКИЦО1 (Россия) при длине волны 492 нм. Уровень аутоантител к ДНК выражали в условных единицах оптической плотности (усл. ед. опт. плотн.) конечного продукта ферментативной реакции для разведения тестируемой сыворотки 1:100.

Для статистической обработки данных использовали пакет программ Statsoft Statistica v. 6.0. Оценку достоверности различий проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Для определения наличия корреляции между отдельными показателями использовали непараметрический критерий Спирмана.

Результаты исследований и их обсуждение. Для выяснения роли Treg клеток (CD4+CD25+-лимфоциты) в механизмах, контроли­рующих иммунологическую толерантность организма у больных ХМЛ были проведены сочетанные исследования, направленные на изучение количественного представительства в ПК Treg-лимфоцитов и содержания в сыворотке крови аутоантител к self-антигенам (в данном исследовании – к нативной двунитевой ДНК – dsДНК).

В группах больных ХМЛ анализировали количество в ПК Treg-лимфоцитов, а также уровень аутоантител классов M и G к dsДНК; данные сравнивали с аналогичными контрольными показателями. Полученные результаты в виде средних значений (M±m) представлены в таблице.

Таблица

Содержание Treg-лимфоцитов и уровень аутоантител к нативной двунитевой ДНК (dsДНК) классов M и G у больных ХМЛ (M±m)

Группы	CD антигены (% позитивных клеток)	Аутоантитела к dsДНК, усл. ед. опт. плотн.
CD4+	CD4+CD25+	Анти- dsДНК-IgM	Анти- dsДНК-IgG
ХМЛ-ФА (n=21)	18,0±0,7	1,2±0,1#	0,172±0,009*	0,232±0,011#
ХМЛ-ХФ1 (n=20)	24,6±1,5	7,1±0,1	0,082±0,006*	0,064±0,0005*
ХМЛ-ХФ2 (n=15)	39,4±1,4	7,0±0,1	0,084±0,0006*	0,062±0,0008*
Контроль (n=203, 304)	44,6±2,7	7,3±0,3	0,049±0,004	0,044±0,01

Примечания:

1 – доноры (в ПК определяли количество CD4+, CD4+CD25+ лимфоцитов).

2 – доноры (в сыворотке крови определяли аутоантитела к dsДНК классов M и G).

* – p<0,05 по сравнению с контролем.

# – p<0,01 по сравнению с контролем.

Отмечено, что у больных ХМЛ-ФА содержание в ПК CD4+CD25+-лимфоцитов достоверно снижено (в 6,1 раза). Как следует из данных таблицы, у этих пациентов уровень аутоантител к dsДНК достоверно значимо отличался от контрольных значений в сторону повышения аутоантител к dsДНК класса M в 3,5 раза и класса G – в 5,3 раза.

На основании полученных данных впервые у этих больных установлена обратная корреляционная взаимосвязь между коли­чест­вом Treg-лимфоцитов (иммунофенотипический профиль CD4+CD25+) и уровнем аутоантител к dsДНК класса M (r=-0,834, p<0,001), а также класса G (r=-0,918, p<0,001).

У больных ХМЛ после терапии в ПК определяли количество Treg-лимфоцитов и уровень в сыворотке крови аутоантител к dsДНК классов M и G. Установлено, что у больных ХМЛ-ХФ1, ХМЛ-ХФ2 количество CD4+CD25+- лимфоцитов не имело достоверных различий с контрольными цифрами. В тоже время обнаружено, что у больных ХМЛ-ХФ1 уровень аутоантител к dsДНК класса M в сыворотке крови достоверно повышен в 1,7 раза, а класса G – в 1,5 раза. Такая же закономерность отмечена у больных ХМЛ-ХФ2, у которых уровень аутоантител к dsДНК класса M достоверно превышает контроль в 1,7 раза, а G – в 1,4 раза.

С учетом данных литературы у больных лейкемией вызывает интерес определение аутоантител к нативной ДНК, поскольку считается, что их наличие отражает развитие аутоиммунного процесса [6, 7]. Следует отметить, что в наших исследованиях у больных ХМЛ аутоантитела к ДНК были обнаружены до проведения им специфической противоопухолевой терапии, т. е. в стадии прогрессии заболевания и это может быть одним из факторов, участвующих в патогенетическом процессе. Полученные результаты согласуются с имеющимися сведениями об участии Treg-лимфоцитов в поддержании иммунологической толерантности организма, поскольку их функция состоит в подавлении активности аутоспецифических Т-лимфоцитов. Подчеркивается, что снижение количества и/или функциональной активности этих клеток может вызывать развитие аутоиммунных процессов [8–10].

Таким образом, у больных ХМЛ повышение в сыворотке крови уровня аутоантител к dsДНК классов M и G сопровождалось снижением количества в ПК Treg-лимфоцитов. На основании результатов можно заключить, что Т-регуляторные лимфоциты с иммунофенотипическим профилем CD4+CD25+-, обладающие супрессорной функцией, выполняют важную роль в механизмах контроля иммунологической толерантности организма у больных ХМЛ.

Литература

1.  Li S. Src-family kinases in the development and therapy of Philadelphia chromosome-positive chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia / S. Li // Leuk. Lymphoma. – 2008. – Vol. 49. – № 1. – P. 319–326.

2.  Chuvez-Gonzulez M. A. Chronic myeloid leukemia in the 21st century: biology and treatment / M. A. Chuvez-Gonzulez, M. Ayala-Sunchez // Mayani Rev. Invest. Clin. – 2009. – Vol. 61. – № 3. – P. 221–232.

3.  Keam S. J. Dasatinib: in chronic myeloid leukemia and Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia / S. J. Keam // BioDrugs. – 2008. – Vol. 22. – № 1. – P. 59–69.

4.  Human CD4+CD25+ thymocytes and peripheral T cells have immune suppressive activity / L. A. Stephens, C. Mottet, D. Mason [et al.] // Eur. J. Immunol. – 2001. – Vol. 31. – P. 1247–1254.