Гематологія і переливання крові (стр. 32 )

Ключевые слова: цитокины, мононуклеары периферической кро­ви, глиомы головного мозга, супернатант прогениторных нейроклеток.

CYTOKINES’ PRODUCTION OF PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS OF PATIENTS WITH BRAIN GLIOMA IN VITRO UNDER THE INFLUENCE OF RAT PROGENITOR NEURAL CELLS SUPERNATANT

L. D. Lyubich

SI «Acad. A.P. Romodanov Institute of Neurosurgery NAMS of Ukraine», Kyiv

Summary. It is established by ELISA of peripheral blood mono­nuclear cells (PBMC) supernatants that under the influence of rat progenitor neural cells supernatant (RPNS) gestation day 12–16 (Е12-16) PBMC of healthy individuals decreased the production of TNF-a and increased the synthesis of IL-1b, IL-10. Under the influence of RPNS in PBMC supernatants of patients with brain glioma the levels of TNF-a and IL-10 were considerably decreased. After the incubation with RPNS the level of IFN-g in PBMC supernatants of patients with brain glioma grade
2–3 demonstrated the tendency to increase; the PBMC of patients with glioblastoma (grade 4) revealed the tendency to decreased IFN-g production.

Key words: cytokines, peripheral blood mononuclear cells, brain glioma, progenitor neural cells supernatant.

Актуальною проблемою використання нейрогенних стовбурових та прогеніторних клітин для розробки новітніх технологій терапії уражень ЦНС залишається питання щодо їх протипухлинного та імуномодулюючого потенціалу. Одним із можливих механізмів реалізації протипухлинних властивостей нейрогенних стовбурових клітин, поряд з іншими, є індукція ефективних імунних реакцій проти внутрішньомозкових пухлин. Відомо, що при гліомах мозку виявляються зміни у всіх ланках імунітету [1]: відносна та абсолютна лімфопенія, знижений вміст CD4+, CD8+, CD16+ лімфоцитів,
HLA-DR-клітин, гальмування проліферативної здатності лімфоцитів, зниження секреції ефекторних цитокінів. Поряд із зниженням кількості та функції CD4+,CD8+ клітин, підвищується кількість Т-регуляторних CD4+ CD25+FoxP3+ клітин: порівняно із здоровими донорами, у CD4+ та CD8+ T-клітин хворих з гліобластомами пригнічені гени, залучені у зв’язування T-клітинного рецептора, активацію та внутрішньоклітинну передачу сигналу, тоді як у Т-регуляторних клітинах цих хворих підвищується рівень транскриптів імуноінгібуючих медіаторів [2].

Мета роботи – дослідити вплив супернатанту прогеніторних нейроклітин щура (СНК) на продукцію про - і антизапальних цитокінів мононуклеарами периферичної крові (МНПК) хворих з гліомами головного мозку.

Матеріали і методи дослідження. Матеріалом слугували МНПК хворих з гліомами головного мозку (n=25) та МНПК осіб групи порівняння (умовно здорові особи без онкологічного захворювання (n=16). При гістологічній верифікації діагнозу у хворих діагностовано 5 гліом 2 ступеня злоякісності, 9 гліом 3 ступеня злоякісності, 11 гліобластом (4 ступінь злоякісності).

МНПК виділяли центрифугуванням у градієнті фікол-верографіну (d=1,077) при 1500 об/хв протягом 30 хв, потім двічі відмивали забуференим фізрозчином рН 7,2–7,4. Життєздатність клітин визначали за проникністю плазматичної мембрани для 0,2% трипанового синього (Merch, Німеччина) [3].

Отримання супернатанту прогеніторних нейроклітин щура (СНК). Для отримання СНК використовували суспензію, виготовлену з тканини мозку щура на 12–16-у добу гестації (Е12-16). Нативну тканину мозку у фізіологічному розчині звільняли від оболонок, переносили в середовище DМЕМ («Sigma», Німеччина) і ресуспендували за допомогою шприца з товстою голкою. Життєздатність клітин у суспензії визначали у стандартному цитотоксичному тесті з 0,2% трипановим синім («Merch», Німеччина) [3]. До отриманої клітинної суспензії (з концентрацією клітин 6,0´106/мл) додавали конканавалін А (0,10 мг/мл) та інкубували 2 год в CО2-інкубаторі при температурі (37,0+0,5)°С, постійній вологості 95% та 5% СО2. Після інкубації клітини осаджували центрифугуванням протягом 5 хв при 1500 об/хв, відмивали у середовищі DMEM, до осаду клітин додавали свіже середовище DMEM, ресуспендували та інкубували в тих же умовах протягом 24 год. Після інкубації клітини повторно осаджували центрифугуванням протягом 5 хв при 1500 об/хв, відбирали супернатант, визначали у ньому концентрацію білка, стандартизували до концентрації 0,1 мг/мл, аліквотизували і зберігали при (-20+0,5)°С.

Препарат СНК у кількості 0,10 мг/мл додавали до суспензії виділених МНПК та інкубували 2 год в CО2-інкубаторі при температурі (37,0+0,5)°С, постійній вологості 95% та 5% СО2. Після інкубації клітини осаджували центрифугуванням протягом 5 хв при 1500 об/хв, відмивали у середовищі DMEM, до осаду клітин додавали свіже середовище DMEM, ресуспендували та інкубували в тих же умовах протягом 24 год. Контролем слугували паралельні проби, які інкубували в тих же умовах, але без додавання СНК. Після інкубації клітини дослідних і контрольних суспензій осаджували центрифугуванням протягом 10 хв при 1500 об/хв, відбирали супернатанти та визначали у них рівень цитокінів.

Вміст цитокінів IFN-a, IFN-g, TNF-a, IL-1b, IL-4, IL-10 у супернатантах МНПК до і після інкубації з СНК визначали імуноферментним методом за допомогою наборів їновий контур» (Санкт-Петербург, Росія).

Статистичну обробку даних проводили із використанням пакету статистичних програм «Statistica 5,0», достовірність різниці оцінювали із застосуванням t-критерію Стьюдента.

Результати та обговорення. Супернатанти МНПК осіб групи порівняння (умовно здорових осіб без онкологічного захворювання) містили досліджувані цитокіни у кількостях, що не перевищували фізіологічну норму, за виключенням TNF-a, середній вміст якого перевищував нормальний показник (0–2,5 пг/мл), вказуючи, очевидно, на наявність запального процесу, ймовірно вірусної етіології, у осіб групи порівняння (рис. 1).

За умов впливу СНК щура вміст TNF-a в супернатантах МНПК осіб групи порівняння достовірно зменшувався (р<0,05) (рис. 1). Крім того, під впливом препарату СНК в супернатантах МНПК осіб групи порівняння достовірно зростав вміст IL-1b (р<0,0028) та IL-10 (р<0,05). Значущого впливу СНК щура на продукцію IFN-a, IFN-g та IL-4 не виявлено (рис. 1).

Таким чином, можна припустити, що препарат СНК щура запускає сигнальні каскади у МНПК осіб групи порівняння, спрямовані на обмеження запального процесу, зменшуючи продукцію TNF-a, збільшуючи синтез IL-1b та активізуючи імуносупресивну функцію (збільшуючи продукцію IL-10).

Рис. 1. Вміст цитокінів у супернатантах МНПК групи порівняння за умов впливу СНК щура, пг/мл

Супернатанти МНПК хворих з гліомами головного мозку подібно до супернатантів МНПК осіб групи порівняння містили підвищену кількість TNF-a, порівняно з фізіологічною нормою, але достовірно нижчу за середній вміст TNF-a у супернатантах групи порівняння (р<0,05) (рис. 2). Це узгоджується з відомими даними [1], згідно з якими у хворих на гліоми головного мозку в сироватці крові спостерігається збільшений вміст прозапального цитокіна TNF-a, що відображає розвиток запальних реакцій у вигляді перифокального набряку у відповідь на ріст пухлини. Інші досліджувані цитокіни виявлені у кількостях, що не перевищували фізіологічну норму.

За умов впливу СНК щура в супернатантах МНПК хворих з гліомами головного мозку достовірно зменшувався вміст TNF-α (р<0,008) (рис. 2), що узгоджується з даними [1], за якими у хворих на гліоми порушується продукція TNF-α у відповідь на стимуляцію мітогеном (ліпополісахаридом).

В той же час, за умов впливу СНК щура в супернатантах МНПК хворих з гліомами головного мозку достовірно зменшувався вміст IL-10 (р<0,05) (рис. 2). IL-10 відноситься до протизапальних, пропухлинних і супресивних цитокінів, оскільки відома можливість його імуносупресивного впливу на формування локального імунітету (через продукцію його CD4+CD25+T-лімфоцитами, що інфільтрують пухлину, та безпосередньо клітинами пухлини), а також стимулюючий вплив IL-10 на ріст пухлини [4]. Зменшення продукції IL-10, на наш погляд, можна розцінити як позитивний вплив СНК, спрямований на обмеження імуноінгібуючої функції імунокомпетентних регуляторних клітин.

Значущого впливу СНК щура на продукцію IFN-a та IL-4 не виявлено (рис. 2).

Рис. 2. Вміст цитокінів у супернатантах МНПК хворих з гліомами головного мозку за умов впливу СНК щура, пг/мл

Вплив СНК на продукцію IFN-g МНПК хворих з гліомами головного мозку виявився неоднозначним і залежав від ступеня злоякісності пухлини. У хворих з гліомами 2 і 3 ступеня злоякісності виявлено тенденцію до підвищення вмісту IFN-g у супернатантах МНПК після інкубації з СНК, тоді як у хворих з гліобластомами
(4 ступінь злоякісності), навпаки, спостерігалась тенденція до зниження продукції IFN-g МНПК (рис. 3). Згідно з даними [1], у хворих на гліоми порушується стимульована ФГА продукція IFN-g клітинами периферичної крові і виявлено прямий зв’язок між ступенем злоякісності гліальної пухлини та порушенням стимульованої мітогеном цитокінсинтезуючої здатності імунокомпетентних клітин периферичної крові: при гліомах 3 та 4 ступеня анаплазії порівняно із пухлинами 1–2 ступеня злоякісності вірогідно пригнічується продукція IFN-g активованими імунокомпетентними клітинами крові, яка не відновлюється після видалення пухлини. Можна припустити, що виявлена СНК-індукована стимуляція продукції IFN-g МНПК хворих з гліомами 2 і 3 ступеня злоякісності обумовлена переключенням імунокомпетентних клітин на Th1-відповідь; тоді як у МНПК хворих з гліобластомами цього не відбувається через пригніченння у лімфоцитах генів, залучених у активацію та внутрішньоклітинну передачу сигналу [2]. Збільшення продукції IFN-g МНПК хворих з гліомами 2 і 3 ступеня злоякісності, на наш погляд, можна розцінити як позитивний вплив СНК, оскільки IFN-g підвищує експресію антигенів МНС І класу та ICAM-1 на клітинах гліом, в результаті чого клітини пухлини стають чутливішими до лізису цитотоксичними лімфоцитами.