Введение в физику белка (стр. 15 )

  Более точно оценить величину e на самых малых близких расстояниях внутри молекулы можно, исходя из величин первой и второй констант диссоциации двухосновных кислот и оснований в воде. Например, диссоциация щавелевой кислоты происходит так:

  Вторая диссоциация сдвинута на »2.5 единицы рН относительно первой, т. е. происходит при в 102.5 = е2.3x2.5 раз меньшей концентрации Н+. Это показывает, что свободная энергия взаимодействия первого заряда со вторым составляет 2.5x2.3RT » 3.5 ккал/моль. И это  —  при расстоянии в »3  между зарядами. Такая величина энергии взаимодействия соответствует e»30?40 на расстоянии в 3 . К сходному результату  —  e» 30?40 на расстоянии в » 2-2.5   —  приводит рассмотрение диссоциации угольной кислоты, Н2СО3® НСО3-® СО3--.

  Значит, даже солевая связь противоположно заряженных боковых групп на поверхности белка должна "стоить" всего пару-тройку ккал/моль. Внутри белка она должна "стоить" больше, но погружение заряженных групп внутрь глобулы обойдется еще дороже  —  так что не надо удивляться, что такие связи в природных белках наблюдаются нечасто.

  Итак, мы пришли к выводу, что корпускулярность не меняет радикально "макроскопическую" (выведенную для больших расстояний между зарядами) диэлектрическую проницаемость воды даже на расстоянии в 2  —  3 , когда между взаимодействующими зарядами не может быть никаких других молекул. Причина этого  —  в том, что заряды достаточно сильно экранируются даже подошедшими "с другой стороны и с боков" (Рис.6-13) молекулами среды, которые поляризуются (в случае воды  —  просто поворачиваются) так, что "+"'ы этих молекул смещается к заряду  , а "-"'ы  —  к заряду .
 
 

Рис.6-13.

  Здесь мы снова (ср. Рис.6-10, 6-11) видим, что электростатическое взаимодействие между зарядами ( и ) как бы проходит в основном через среду с более высокой диэлектрической проницаемостью и почти игнорирует среду, которая слабо поляризуется.

  Все, о чем мы говорили до сих пор, относилось к "мелкомолекулярным" системам. Сохраняются ли все эти выводы для белков?

  Опыты, проведенные в лаборатории Фершта  —  зачинателя белковой инженерии  —  показывают, что приведенные выше оценки в полной мере относятся и к белкам.
  Опыты основывались на следующем. Есть белки, ферменты, активность которых особенно велика при определенном значении рН (у них, как говорится, есть рН-оптимум).
  Вводя в белок, путем мутации его гена, заряженный остаток, можно сдвинуть этот рН-оптимум (Рис.6-14)  —  и, по его сдвигу, оценить электрическое поле, созданное мутировавшим остатком в активном центре.
 
 
 

Рис.6-14.

 

  Причина рН-оптимума  —  в том, что какая-то группа в активном центре должна, для успешной работы фермента, находиться в определенной зарядовой форме, а заряженность этой группы зависит от концентрации водородных ионов в среде.
  Пусть активный центр (АЦ) принимает ион Н+: АЦ + Н+ = АЦН+. Тогда, по закону действующих масс, соотношение концентраций двух (с Н+ и без Н+) форм активного центра составляет [АЦН+]/[АЦ] = exp(-DFАЦН+/RT) x [H+] = exp(-DFАЦН+/RT) x 10-рН = exp{-(DFАЦН+/RT + 2.3 x рН)}, где DFАЦН+  —  свободная энергия связывания Н+ с активным центром, а значок [ ] означает концентрацию.
  Если мутация вносит в белок заряд, создающий в его активном центре потенциал j, то DF АЦН+ меняется: DF АЦН+|с_мутацией = DFАЦН+ |без_мутации + je, где e  —  заряд Н+. Так как в рН-оптимуме величина [АЦН+]/[АЦ] (и, следовательно, величина DFАЦН+/RT + 2.3 x рН) должна быть одной и той же и при, и без мутации,  —  то DFАЦН+|без_мутации /RT + 2.3 x рН|опт._без_мутации = DFАЦН+|с_мутацией /RT + 2.3 x рН|опт._с_мутацией. То есть je = DFАЦН+|с_мутацией  — DF АЦН+|без_мутации = 2.3RT(рН|опт._без_мутации  —  рН|опт._с_мутацией) = 2.3RTx(-DрН).
  Так, зная сдвиг pH-оптимума, можно оценить потенциал, созданный в активном центре мутированным остатком белка. Теперь, зная трехмерную структуру этого белка и, следовательно, расстояние r от мутированного остатка до активного центра,  —  можно оценить эффективную диэлектрическую проницаемость eэфф (входящую в формулу j = q/eэффr) для взаимодействия внесенного мутацией заряда q с районом активного центра.
  Мутации в опытах Фершта вводились на поверхность белка, чтобы не разрушить его структуру (мы уже знаем, что энергия глубоко погруженного в белок заряда очень велика, так что он может буквально взорвать белок).
  Результат: эффективная диэлектрическая проницаемость eэфф колебалась в этих опытах от ~40 до ~120, причем первое характерно для близких к активному центру мутаций, а второе  —  для удаленных от него. Последнее  —  то, что eэфф может достигать 120  —  вызвало изрядное удивление, так как многие, не знакомые как следует с электростатикой, считали, что eэфф должны лежать где-то между 3 (как внутри белка) и 80 (как в воде). Однако нас эти величины удивлять не должны  —  они хорошо согласуются с тем, что можно ожидать из Рис.6-10.

  Небольшое отступление  —  о белковой инженерии. Ее главная прелесть заключается в том, что, меняя такой-то кодон в гене белка, мы можем ввести мутацию в точно определенное место белковой глобулы, так как и ген этого белка, и его аминокислотная последовательность, и его трехмерная структура известны. Кроме того, влияние мутации на структуру также можно контролировать  —  рентгеноструктурным анализом или ЯМР. Таким образом, вся работа ведется с открытыми глазами.
  В опытах, о которых шла речь, белок служит микроскопическим (вернее, наноскопическим) электрометром. И белковая инженерия дает возможность использовать такие приборы  —  и при этом прыгать от физической теории к генным манипуляциям и обратно, что чрезвычайно занимательно.

  Теперь я хочу сделать несколько добавлений касательно электростатических взаимодействий.

  Первое. До сих пор я говорил только о взаимодействии отдельных зарядов. Однако к электростатике относятся и взаимодействия диполей (например, диполей Н(+)-О(-) и Н(+)-N(-), вовлеченных в образование водородных связей), а также квадруполей  —  последние присутствуют, например, в ароматических кольцах (Рис.6-15).
 
 

Рис.6-15. Электрический квадруполь ароматического кольца: слой "половинок" p-электронов (заряд -3) — слой ядер (заряд +6) — слой вторых "половинок" p-электронов (заряд -3).

  Я остановился на взаимодействии зарядов потому только, что они наиболее сильны,  —  даже при прямом контакте они в несколько раз сильнее, чем взаимодействия диполей (и к тому же медленнее спадают с расстоянием), а взаимодействия диполей,  —  сильнее, чем взаимодействия квадруполей.

  Второе. При наличии свободных зарядов (например, соли) в воде, электростатические взаимодействия ослабевают с расстоянием r не по закону "энергия пропорциональна (1/r)", а гораздо быстрее  —  как (1/r) x exp(-r/D). Здесь D  —  радиус Дебая-Хюккеля  —  соответствует характерному размеру противоионного облака вокруг заряда. Величина D не зависит от самого заряда, но зависит от концентрации ионов в среде, от ее диэлектрической проницаемости и температуры. В воде, при комнатной температуре,
 

D » 3/I1/2,

(6.5)

где

I = 1/2 åi ci zi2 —

(6.6)

ионная сила раствора в моль/литр. В формуле (6.6) сумма берется по всем сортам ионов в растворе, причем zi  —  заряд (в единицах протонного заряда), а ci  —  концентрация (в моль/литр) иона i. Обычным физиологическим условиям соответствует I » 0.1-0.15; при этом D » 8. Однако некоторые микроорганизмы живут при I ~ 1 моль/л и выше; при этом сохраняются, и то в очень ослабленном виде, только те электростатические взаимодействия, что соответствуют "солевым мостикам", т. е. прямому контакту зарядов.
  В целом, при наличии в растворе ионной атмосферы, энергия взаимодействия двух зарядов имеет вид