Введение в физику белка (стр. 48 )

  Рис.17-7. Изменение энергии E, энтропии S и свободной энергии F=E-TS с изменением плотности глобулы. D  —  денатурированное состояние (в данном случае  —  расплавленная глобула, так как плотность его велика), N  —  нативная глобула, #  —  "барьер", максимум свободной энергии на пути равномерного расширения глобулы (от N к D).
 
 

  Обратимся еще раз к уравнениям (17.1). Они показывают, что отношение скоростей прямой и обратной реакций, kА®В/kВ®А, есть просто константа равновесия между финальным (В) и начальным (А) состояниями
 

КВ:А = kА®В/kВ®А = exp[-(FВ-FA)/RT] .

(17.4)

  Величина константы равновесия КВ:А есть nB¥/nА¥, она показывает то соотношение между финальным числом nB¥ молекул в состоянии В и их финальным числом nA¥ в состоянии А, к которому, в конечном итоге (при стремящемся к бесконечности времени наблюдения), приходит процесс при данных условиях (температуре и т. д.).
  С какой скоростью система приходит к этому равновесному состоянию? Для ответа решим соответствующее дифференциальное уравнение:
 

dnA/dt =  - kА®В nA + kB®A nB

(17.5)

(второе уравнение, для dnB/dt, писать не надо, т. к. nA+ nB º n0, где n0 —  полное число молекул, т. е. dnВ/dt º -dnА/dt). Ответ  —  позвольте мне написать его без выкладок, а вам я рекомендую сделать их самостоятельно  —  таков:
 

nA(t) = [nA(0)  —  nА¥] exp[-(kА®В + kB®A)t] + nА¥ .

(17.6)

  Здесь nA(t)  —  число молекул в состоянии А в момент времени t от начала процесса, а nА¥ = n0.[kВ®А / (kА®В + kВ®А)]   —  конечное, равновесное число молекул в состоянии А.
  Значит, видимая (apparent) скорость приближения к равновесию есть
 

kapp = kА®В + kВ®А,  —

(17.7)

она равна сумме скоростей прямой и обратной реакций. Обратите внимание, что эта скорость зависит только от условий, в которых протекает релаксация, и не зависит от исходного распределения белковых молекул между нативным и денатурированным состояниями [т. е. от исходной доли nA(0)].
  В этой суммарной скорости kapp доминирует более быстрая реакция.
  Если условия (температура и т. д.) отвечают большей устойчивости нативного состояния,  —  то в kapp = ku®N + kN®u  доминирует ku®N, скорость сворачивания. Если более устойчиво денатурированное состояние,  —  то в ku®N + kN®u доминирует kN®u, скорость разворачивания.
  Большим преимуществом измерения скорости прихода к равновесию, kapp, является то, что она всегда может быть измерена (в отличие от ku®N и kN®u в отдельности),  —  как тогда, когда более стабильно нативное состояние, так и тогда, когда более стабильно денатурированное.
  При измерении kapp строятся так называемые "шевронные графики" (Рис.17-8). Они так называются из-за своей характерной V-образной формы, напоминающей шевроны на военных кителях. Один взгляд на этот график показывает, что скорости сворачивания (ku®N) и разворачивания (kN®u) зависят от концентрации денатуранта противоположным образом. С аналогичной ситуацией мы уже сталкивались, когда изучали температурную зависимость скоростей сворачивания и разворачивания белка. Как и тогда, наблюдаемая здесь противоположность наклонов означает "промежуточность" свойств переходного состояния, их среднее положение между свойствами нативного и развернутого белка.
 
 
 

  Рис.17-8. "Шевронный график" зависимости kapp = ku®N + kN®u, видимой характерной скорости приближения к равновесию между нативной и развернутой формами белка (лизоцима куриного яйца), от концентрации гуанидингидрохлорида. Заполненные кружки получены при разбавлении раствора GdmCl, в котором изначально находился денатурированный белок, т. е. при полной или частичной ренатурации белка. При этом kapp » ku®N. Пустые кружки получены при добавлении GdmCl к изначально нативному белку, т. е. при полной или частичной его денатурации. При этом kapp » kN®u. Пунктир показывает экстраполяцию величин ku®N и kN®u в области излома шеврона. Отклоняющиеся от экстраполяционной прямой точки в верхней левой части графика (т. е. вдали от точки излома, от точки денатурации белка) свидетельствуют либо о какой-то перестройке переходного состояния, либо о появлении каких-то дополнительных метастабильных интермедиатов (возможно, типа расплавленных глобул), которые могут лежать как на, так и вне основного пути сворачивания. Обратите внимание, что все эти перестройки и/или интермедиаты не повышают скорость сворачивания по сравнению с той, что можно было бы ожидать при неизменности переходного состояния: отклоняющиеся точки лежат ниже интерполяционной прямой. Картинка, с небольшими изменениями (добавлены экстраполяционные пунктиры) взята из T. Kiefhaber Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:9029-9033.
 
 

  Действительно, то, что денатурант вообще разворачивает белок, показывает, что он сильнее притягивается к развернутому белку, чем к нативному. То, что денатурант замедляет сворачивание исходно развернутого белка (см. спад скорости в левой части Рис.17-8) показывает, что он сильнее притягивается к исходному, развернутому белку, чем к переходному состоянию; а то, что денатурант ускоряет разворачивание исходно нативного белка (см. подъем скорости в правой части Рис.17-8),  —  показывает, что он сильнее притягивается к переходному состоянию, чем к исходному, нативному. Это означает, что контакт переходного состояния с денатурантом больше, чем у нативного белка, но меньше, чем у денатурированного. Иначе говоря, приведенный на Рис.17-8 шевронный график показывает, что переходное состояние по степени контакта с растворителем, т. е. по своей компактности находится где-то на полпути между развернутым и нативным состояниями белка. Этот график дает даже больше: так как наклон для kN®u несколько меньше, чем для ku®N, то компактность переходного состояния несколько ближе (в данном случае) к оной у нативного белка, чем у денатурированного.
  Рисунок 17-8 относится к лизоциму  —  белку, денатурация которого гуанидингидрохлоридом приводит прямо к образованию клубка, а не расплавленной глобулы. При умеренных концентрациях денатуранта (при не очень сильном его разбавлении водой) лизоцим сворачивается довольно медленно, за многие минуты. Однако при самоорганизации в почти чистой воде (происходящей при сильном разведении водой крепкого раствора гуанидингидрохлорида, где находились клубкообразные белковые цепи), скорость сворачивания лизоцима максимальна,  —  и уже слабо зависит от остаточной концентрации денатуранта. При этом в сворачивании лизоцима появляется компактный метастабильный интермедиат типа расплавленной глобулы,  —  интермедиат, который не наблюдается при повышенных концентрациях денатуранта. Появление компактных метастабильных интермедиатов сворачивания, вообще говоря, всегда "выполаживает" зависимость скорости сворачивания от содержания денатуранта  —  см. левый край Рис.17-8. Известно, что ренатурация белка, стартующая не от клубка, а от расплавленной глобулы (например, ренатурация карбоксиангидразы), также демонстрирует довольно слабую зависимость скорости ренатурации от концентрации денатуранта. Последнее означает, что переходное состояние в таком сворачивании мало отличается от исходной расплавленной глобулы по компактности.

  Иначе говоря, переходное состояние  —  по "промежуточности" некоторых своих свойств между свойствами нативного и развернутого белка  —  напоминает расплавленную глобулу. Но это не означает, что переходное  —  подчеркнем, нестабильное  —  состояние действительно похоже на расплавленную глобулу. Эксперимент показывает скорее, что переходное состояние можно представить себе (если речь идет о переходе "клубок ® нативный белок") как частично свернутый нативный белок, остальная часть которого все еще находится в денатурированном, клубкообразном состоянии. Вид переходного состояния для переходов типа "расплавленная глобула ® нативный белок" (или "клубок ® расплавленная глобула ® нативный белок") еще не установлен экспериментально, но весьма правдоподобно, что оно включает часть нативной глобулы, в то время как прочая цепь находится в состоянии расплавленной глобулы.

  Природу переходного состояния удалось выяснить с помощью белковой инженерии. Применяя множество мутаций, и анализируя соответствующие им изменения в шевронных графиках (см. Рис.17-8, 17-9), удается  —  ценой колоссального труда  —  узнать, какие именно остатки вовлечены в "нативоподобную" часть переходного состояния, а какие  —  нет. Этот метод был разработан А. Ферштом а Англии. Строго говоря, пока что он применяется только к белкам, денатурация которых приводит прямо к образованию клубка, а не расплавленной глобулы.